协议

ES细胞的制备对于囊胚注射

前5天注射

解冻ES细胞在37℃水浴中的小瓶

转移小瓶的内容到一个锥形管，用10ml的ES细胞培养基稀释冷冻介质，并且还以分散细胞

沉淀通过缓慢离心（<1500rpm），由细胞5分钟

除去上清液并轻轻拍打管，以分散细胞

添加4毫升ES细胞培养基，并转移到一个新的6-cm的进给器板

培养在组织培养恒温箱（37℃，5％CO₂）为2〜3天，每天都在变化的媒体

通道中的细胞通过电镀500,000个细胞到新鲜6厘米进给器板

每天都在变化的媒体

传代后两天将ES细胞注入最好

注射日

再给文化注入上午

REFEED再次前2小时注入培养

制备10毫升胚泡注射介质*（见下文）
存储在冰上。

制备ES细胞注射通过产生单细胞悬液：

1. 从6厘米压板上取下ES细胞培养基
2. 添加1.0毫升胰蛋白酶。
3. 孵育在组织培养培养箱中10分钟。
4. 加入2mL胚泡注射介质。分散细胞与P1000吸管吸取彻底。检查细胞在范围为良好的分散性（我们需要的单细胞供注射用）。
   
5. 放置细胞悬浮液在一个15毫升的Falcon管中。
6. 沉淀细胞通过缓慢离心（小于或等于至1000rpm）3分钟。移除上层清液，然后点击管轻轻地以分散细胞。
7. 加入2mL胚泡注射介质的
8. 置于冰上此ES细胞悬浮液和附加的囊胚注射介质并提供给GEMF。

*囊胚注射媒体

• 10毫升DMEM + 10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺的
• 加入200μl（微升）1M HEPES

DNA的制备用于电穿孔导入ES细胞

1. 制备靶向载体质粒中的至少30微克。我们建议凯杰EndoFree质粒Maxi试剂盒。可替换地，可以使用标准的质粒协议随后CsCl显带
2. 通过用独特的酶消化线性化靶向载体
3. 消化后，通过微型凝胶运行的一小部分检查完整的线性化
4. 沉淀DNA用两倍体积的乙醇和0.3体积的7.5 M醋酸铵
5. 洗涤沉淀2X用干净的70％乙醇
6. 重悬DNA在0.1X TE *以1.0mg / ml的浓度。共线性化DNA的25微克需要用于电穿孔。

注意：

• 这是与乙酸铵沉淀DNA非常重要，而不是通常使用的乙酸钠
• 它根据上面而不是水或PBS协议以重悬在TE 0.1X DNA沉淀是同样重要的
• 不遵守上述任一会极大地影响转化效率

DNA的制备用于原核注射

1. 制备30-50微克的DNA。我们建议您使用质粒制备协议，在无内毒素的，干净的质粒DNA的结果。的EndoFree Qiagen试剂盒是适用于该目的。
2. 消化足够转基因构建以释放20微克的片段待注射。（要引入的片段必须是自由的所有载体序列）。
3. 消化后，通过在凝胶上运行DNA的稀释部分检查完全消化。相较于未切割质粒的车道，并在消化超载车道（检查其他不需要的产品）。采取这种凝胶的清晰图像

使整个消化反应于用于注射的设施与凝胶的图像沿，清楚地表明该片段被注入。该设施将进一步净化注射的片段。

请联系工厂主管对大的DNA（青年中心，BAC的等），特殊准备程序

尾DNA提取

1. 在1.5毫升试管地方尾样品与0.75毫升尾缓冲器*。
2. 孵育在55℃下过夜摇动。
3. 1吨苯酚：氯仿，然后氯仿的等体积用等体积的1提取物消化溶液。
4. 沉淀DNA用等体积的异丙醇。
5. 降速沉淀10分钟。
6. 反转管以丢弃上清液。
7. 通过放置在室温下倒置在纸巾一小时管的干粒料。
8. 重悬DNA沉淀中加入80μl的TE中。