标准操作程序-北校区

单击下面的红色加号以查看每个项目的标准操作程序。

试剂

• histopaque-1077（西格玛＃1077-1）
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

过程

1. 加入15ml锥形离心管，加入5.0 mL组织盖-1077并带到室温。
2. 在单独的15ml管中制备样品混合物：将5ml血液/骨髓混合用5ml PBS混合。
3. 将血液/骨髓精细地覆盖在组织液上。在没有刹车的室温下，400xg离心20分钟。
4. 单核层作为位于两个解决方案之间的界面处的白色阴天层可见。小心地吸出与巴斯特移液管的界面并转移到另外的15ml管中。
5. 用PBS填充该管，将500×g离心5分钟。
6. 吸出上清液并丢弃。
7. 用5.0ml PBS重悬细胞沉淀并重复步骤5和6。
8. 丢弃上清液并将细胞颗粒重悬于1ml PBS中。
   

试剂

• 组织盖1119（Sigma＃1119-1）
• 历史档案1077（西格玛1077-1）
• 磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)

过程

1. 将3ml组织型1119加入15ml锥形离心管。
2. 小心地将3ml的Histopaque 1077涂到Histopaque 1119上。
3. 小心地将6毫升全血铺在步骤2所述试管的上梯度上。
4. 在室温下以700 xg离心30分钟。
5. 小心地拆下离心管。应该观察到两个不同的不透明层。
6. 吸气并丢弃流体到0.5cm的层A内。将细胞从该层转移到标记为“单核细胞”的管中。
7. 将剩余液体抽吸并丢弃到b层0.5 cm内，将细胞从b层转移到标有“粒细胞”的管中。
8. 通过加入10mL PBS洗涤细胞。离心10分钟以500 x g。取下上清液并丢弃。
9. 用巴斯德吸管轻吸重悬细胞。
10. 重复步骤8和9。
11. 重悬于适当体积的PBS中的细胞并根据需要使用。
    

非固定裂解溶液

氯化铵溶解

10x浓度

用90毫升双蒸水稀释10毫升股票。储存在4°C。

• NH4Cl（氯化铵）80.2g
• 碳酸氢钠8.4 g
• EDTA（二钠）3.7克

工作解决方案

QS到1升双蒸馏水。在4°C存储股票长达六个月。

过程

1. 在10ml肝素化管中获得整个样品，优选防腐剂。
2. 将2mL等分为四个50ml锥形离心管中的每一个。
3. 立即用冷1x裂解溶液填充50毫升的管。
4. 在室温下摇滚10分钟。
5. 以250×g在4℃下旋转10分钟。
6. 倒存上清液并允许管道短暂排出。
7. 通过拖管穿过管架重悬颗粒(即，刮颗粒)。
8. 将两个颗粒与一个50ml管中。用冷PBS填充10毫升洗涤。
9. 如上所述，旋转，倾析和刮去颗粒。
10. 将两根颗粒结合成一个管并用10mL冷PBS洗涤。
11. 旋转，倾析和刮去颗粒。根据需要使用单元格。

笔记：这种渗透裂解方法不会损害白细胞或改变膜不对称。由于渗透溶解方法，10倍的原料必须用水稀释至1倍。使用诸如PBS的缓冲液改变裂解缓冲液的渗透性，它将不再有效。该裂解技术将使所有白细胞的所有群体留下，包括粒细胞。

贡献：弗吉尼亚州Snell.

进一步阅读：从流式细胞术方式修改，J.Paul Robinson，编辑，Wiley-Liss Inc.

固体组织的所有流式细胞术研究的一个共同特征是在染色和分析之前要求分散到单细胞（或核）中。可以通过各种方法实现用于流式细胞术分析的固体肿瘤的分散，其中大部分方法采用机械和酶分解的组合。分散方法的选择取决于要检查的材料的类型和要测量的点。此外，需要特殊处理：

血细胞计数器网格系统

误差可以以多种方式引入：稀释误差，移液期间细胞的损失，细胞悬浮悬浮液，腔室过度或欠填充，在它们沉淀之前的细胞计数。腔室中细胞的随机分布是另一个误差源，但可以通过计算大量细胞来补偿。在使用之前和刚刚过后的清洁室。如果腔室装载过重，则清洁并重新开始;不要试图去除多余的液体。

例:台盼蓝1:1稀释细胞悬液

网格#1(16个方格)= 195个单元格
网格#2(16个方格)= 177个单元格
网格＃3（16个方格）= 204个细胞
网格＃4（16个方格）= 166个细胞

总数= 742个单元格
平均值= 185.5细胞

公式:细胞浓度(cells/mL)=均值x (10) x稀释因子
= 185.5 x（104）x 2
= 3.71 x 106细胞/ ml

1. 将试管在37°C水浴中短暂孵育，快速解冻冰冻的细胞瓶，直到样品变成泥浆。用70%乙醇擦拭试管。
2. 将样品转移到含有10-13mL RPMI 1640的15ml锥形管，将培养基温热至37℃。
3. 立即以800×g离心细胞。去除上清液。
4. 用10mL RPMI洗涤电池2x完成。离心细胞。
5. 重悬于所需缓冲液或介质中的细胞，并根据需要使用。

笔记：DMSO是一种极性平面分子，它不仅是一种分化剂，而且对细胞具有毒性。这种毒性在温暖的温度下表现出来。因此，尽快将细胞从冷冻培养基中取出是非常重要的。这是通过立即将解冻的细胞悬液稀释到大量的培养基中，并离心细胞以去除稀释的DMSO来完成的。

1. 用无菌方法裂解红细胞或Ficoll细胞。用冷的无菌培养基1X次洗涤细胞。
2. 在冷培养基中重悬细胞。计数细胞。离心机样本。
3. 细胞应以10-20 × 106个细胞等量冷冻。每管将颗粒重悬在500µL冷培养基中。
4. 在冷冻管上贴上适当的标签:

细胞系：

细胞系的名称
日期
段落号码（如果已知）
细胞来源
细胞的数量

主要组织：

姓氏和患者的第一个首字母
MD安德森数量
日期
诊断
组织类型(BM, PB, Ph)
处理(F=卷曲，L=裂解)

5.在轻轻旋转的同时，在RPMI下降中加入等量的冰冻介质（配方以下）。RPMI细胞悬浮液与冷冻介质的比例应始终为1：1。
6.将1 mL的细胞悬浮液加入相应的crytubes。把管子放在冰上。

在-70°C冰箱中冻结

1. 将试管放入已经冷却到4°C的冷冻箱中。
2. 将冷冻仪放入-70°C冰箱中。
3. 第二天将冷冻瓶移到液氮冰箱中。
4. 在冰箱中存放空冰冻。
5. 用于控制冰箱中的冻结：
   °您可能需要一根试验管作为偏偏冷冻机的内部控制。在冷冻局部500μLRPMI和500μL冷冻培养基中。用准备的管子穿上冰。
   °将偏厚的冷冻室冷却至4°C。
   °丧失丧失的地方。冷冻过程需要大约一个小时。
   立即将试管移到液氮冷冻器中。

冷冻剂

40毫升Hank的缓冲盐水溶液（HBSS） - Ca + 2，-mg + 2
20毫升DMSO
40毫升胎牛血清
100毫升

笔记：二甲基亚砜是一种极性平面分子，它不仅是一种分化剂，而且对细胞也有毒性。这种毒性在温暖的温度下表现出来。因此，在最后一步添加二甲基亚砜是非常重要的。一旦添加二甲基亚砜，将细胞保持在冰上，并尽快开始冷冻过程。二甲基亚砜在冷冻过程中保持细胞的存活防止细胞内的水结晶和脂质膜破裂。

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评估碘化钛表面标志物的细胞周期表达，从染色所需样品的标准程序及其同种型对照开始。然后必须在备受沉备之前固定细胞，并且可以使用两种方法：乙醇或多聚甲醛基固定。所用方法应取决于要测量现象的重要性。乙醇固定可以为调查仪提供优异的CV用于DNA分析，而多聚甲醛技术随后是乙醇而言，最好保留表面标记荧光。

1. 基于乙醇的固定：
   
   加入0.7 mL冰点100%乙醇至1 × 10⁶染色的细胞含有0.3mL冷PBS。在-20℃下孵育30分钟或过夜。离心和去除上清液。
   
   或者,
   
   多聚甲醛固定:
   
   在PBS中加入0.5ml 2％多聚甲醛至1 x 10⁶染色细胞在0.5mL PBS中。在4℃下孵育30分钟。用冷PBS离心和洗一次。样品可以立即染色或在4°C下储存长达一个月。
   
   
2. 在含有1.12%柠檬酸钠的PBS中向细胞颗粒中添加250µL的500单位/mL核糖核酸酶。轻轻旋转并在37°C下培养30分钟。
3. 将250μl碘化钛（Sigma）加入50mg / ml以样品。在黑暗中在室温下孵育至少1小时。
4. 在流式细胞仪上读样品。

1. 2 x 10⁶细胞用两种标记FITC、PE或PERCP的单克隆抗体染色。遵循表面标记染色的标准程序。并行处理适当的同型控制。
2. 在4℃下用0.5％多聚甲醛（1mL）固定30分钟30分钟。
3. 500 x g离心5分钟。
4. 在室温下将细胞重悬于0.1％Triton-X-100（在PBS中）3分钟。
5. 离心细胞并用PBS洗涤两次。
6. 加入DAPI，最终浓度为1µM;孵育1小时或在黑暗中过夜。

试剂

• 储备溶液AO:1 mg/mL
• 磷酸盐 - 柠檬酸缓冲液（pH6.0）
  • 37ml 0.1米柠檬酸
  • 63 mL 0.2 M Na₂HPO₄
• 解决方案A.
  • 0.1 ml Triton X-100（最终0.1％）
  • 8.0 ml 1N HCl（0.08 n最终）
  • 0.877 g NaCl（0.15 n最终）
  • QS到100毫升与dH₂O.在4°C，黑暗中保存6个月。
• 解决方案B.
  • 100毫升磷酸盐 - 柠檬酸缓冲液
  • 0.877 g NaCl（最终0.15米）
  • 34毫克EDTA（最终1毫米）
  • 0.6 ml库存AO（20μm）
  • 4°C避光保存6个月。
  • 对于分配瓶，溶液A使用0.4 mL，溶液B使用1.2 mL（在铝箔包装瓶中）
• 核分离培养基:
  • 10 mm tris缓冲液（pH 7.6）
  • 1mM柠檬酸钠
  • 2毫米MgCl₂
  • 0.1％（v / v）非离子洗涤剂非图形P-40

未固定细胞染色

1. 转移200µL细胞悬浮液（最多2 x 10⁵细胞)到流式细胞术管。
2. 在冰寒冷。轻轻地加入400µL Solution A，在冰上等待15秒。
3. 在接下来的3-15分钟内轻轻加入1.2ml冰冷溶液B并测量细胞发光。

固定细胞

1. 在4℃下固定在70％乙醇中的细胞。
2. 洗涤细胞（250×g，10分钟）两次去除乙醇，并在2 x 10中重悬pbs⁶/毫升。
3. 用上述溶液A和B对200µL细胞悬液进行染色。(Triton X-100对于固定的细胞是没有必要的)。

为了估算反应的特异性，取出乙醇并重新悬浮在PBS中的细胞。在AO染色之前，在37℃下与RNase（103u / ml）孵育30分钟。与未与RNase治疗的样品进行比较。

注1：AO浓度很关键。如果细胞数很高（>2 x 10⁶/mL)，结合AO的量比例较高，游离染料可被降低。RNA变性可能不完全，有些RNA染色呈绿色。因此，稀释细胞悬液。

注2:如果测量是在喷嘴外(即在空气中)进行的，染料扩散是在气流离开喷嘴后进行的。这样可以降低AO的实际浓度。因此，在溶液B中增加AO浓度至60µM，并增加流速。重要的是要确定正确的浓度和流速的个别机器。

注3:过滤器:使用640或650纳米的长通过滤器，而不是610或620纳米的AO结合到RNA(减少DNA成分)。

注4:大多数商业仪器都很好。以下仪器需要更高的AO浓度（即，约25-60μm）来补偿染料扩散：FACS II，FACS II，FACSI，IV和C和30-H CytoFluorograf。

注5:对于ortho-50h，非分拣频道优于排序。

采集和分析

获取吖啶橙色的样品时，FacScan的双重鉴别（DDM）功能必须亮起。DDM设置将为FL1，因为AO荧光在与DNA结合时的荧光。AO的增益设置是在设置时的理想选择。很少需要调整这些增益。所获取的参数是线性模式下的FL1区域，FL1宽度，FL3高度，在日志模式下为FL1高度。五千个细胞通常足以进行此测量。

使用样品设置机器时，最好使用控制单元群。尽管细胞的散射特性通常在渗透后不感兴趣，但调整的第一个参数应该是SSC v。FSC以确保正在获取所有细胞，并消除不必要的碎片获取。调整的第二个设置应为FL1面积V. FL1宽度。它是传统的，g₀-G₁FL1区域的峰值应设置在200左右。接下来，查看FL1高度v。FL3高度或FL1区域v。FL3高度，设置RNA（FL3），使G₀RNA水平更靠近左侧和g₂M RNA不会延伸到右侧，基本上位于屏幕的中心。此时，可以获得样品，并且对于其他样本也应该不适或几乎不调整。如果使用多个小区线，则可能需要单独调整不同的线路。对于“分析见”，显示FL1面积V.FL1宽度。在单身旁门留出一个门。显示FL1高度v。FL3高度，带上逻辑门₁．在FL1高度的次二倍体区域左下方做另一个门以排除死亡细胞。在'Gate Specs'上，将G3=R3改为G3= R1和R2。显示FL1高度的直方图，带有G3上的逻辑门控。您必须将逻辑门组合为R1和r2或门不会组合。在直方图的低倍解区域上制作标记。得到的百分比是百分比凋亡细胞。

贡献：弗吉尼亚州Snell.

进一步阅读：

Darzynkiewicz，Z.用吖啶橙对完整细胞和分离细胞核中的DNA和RNA进行差异染色。《细胞生物学方法》第33卷。Z.Darzynkiewicz&H.Crisman主编，学术出版社，纽约，1990年。第285-298页。

采用流动细胞计数器的手册，J.Paul Robinson，编辑，Wiley-Liss Inc.

该技术旨在检测M相细胞的基于不同细胞周期相中的细胞对部分酸性变性同等敏感。

1. 通过在玻璃管中加入4.5mL冷70％乙醇来固定500μLPBS中的10E6细胞。此时，样品可以存储在4°C以供将来使用。
2. 离心细胞，去除上清，用1ml HBSS重悬。
3. 用1:5000稀释的100µL高纯度核糖核酸酶（例如，沃辛顿）处理。在37°C下培养45分钟。
4. 将200-μL等分试样混合在pH 1.4的0.1M KCl和0.1M HCl的500μL缓冲液中。
5. 在含有0.1M柠檬酸的缓冲液中加入2.0ml5μg/ ml吖啶橙，0.2M na₂HPO₄在pH值2.6。
6. 在流式细胞仪上立即测量。

1. 用浓度为10µg/mL的IdUr或BrdUr在37°C下标记细胞30分钟。在1500 rpm下用PBS清洗1X细胞5分钟。
2. 将颗粒重悬于70％乙醇中，同时轻轻涡旋以固定细胞。将细胞在4℃下储存至少24小时或最多一个月。
3. 分离细胞核：
   
   5 mL 0.025-0.01%胃蛋白酶(Sigma) w/v在0.01N HCl中孵育细胞1小时或在37°C的最佳时间。
   
   涡旋细胞悬浮30秒的单细胞悬浮液。对于实体肿瘤，可能需要通过18号针的细胞悬浮液并通过35微米尼龙网过滤。
   
   2000转离心5分钟(Sorvall Technospin)。
   
   
4. 在37°C的1ml 2N HCl中重悬颗粒20分钟。
5. 中和HCl，用2mL硫酸盐的2mL 0.1米（使用2×HCl体积）。以2000 rpm离心5分钟。在PBTB（2000 rpm / 5分钟）中洗涤2x。
6. BrdUr的染色样品：
   
   在150μLBrdur特异性抗体（CalTag）中重新悬浮2E6核，在黑暗的室温下在PBTB中稀释1：500V / V 1小时。[我们目前正在使用以1:10的浓度稀释的另一个来源（Dolbee）的BR3，以终浓度为1：500，因此使用稀释股1:50]。
   
   用PBTB清洗2X(2000转/5分钟)。
   
   将颗粒重悬于150μlGam-FITC IgG（Sigma）中稀释1:50 v / V在PBTB中稀释，在黑暗中在室温下孵育1小时。
   
   用PBTB清洗2X(2000转/5分钟)。
   
   
7. IdUr染色样品:
   
   用20µL IdUr/BrdUr特异性B44-FITC抗体(Becton Dickinson)在PBTB中稀释1:2 v/v重悬2e6核，室温黑暗孵育1小时。
   
   用PBTB清洗2X(2000转/5分钟)。
   
   
8. 将10µg/mL PI重悬于2ml PBTB中。核悬浮液在4°C保存至少一个小时，最好隔夜。
9. 在流动前30分钟(37℃)加入Rnase，最终浓度为10µg/mL。

笔记
显然，由于在该程序中使用胃蛋白酶来从细胞核中剥离细胞质，因此必须具有尽可能均匀的细胞群，因为细胞标识将丧失。还有其他不使用胃蛋白酶消化的方法，但这种方法给出了PI染色的最佳CV以及标记和未标记的idur和Brdur之间的最具分离。当需要细胞周期动力学的分析时，这些条件是理想的，例如潜在的倍增时间（TDPOT）和S相的持续时间（DS）。如果一个人只希望标记指数（用核苷类似物标记的细胞的百分比）和/或细胞表面染色，则另一种不使用胃蛋白酶消化的方法更合适。

几乎所有用BrdUr或其他核酸类似物进行染色的方法都使用相同技术的细微变化。在所有方法中，第一步是用模拟标记单元格。潜伏期的方法，即使用脉冲或脉冲/追踪或多重标记稍后讨论。第二，这种方法使用胃蛋白酶消化从细胞核中剥离细胞质。胃蛋白酶自然存在于胃中，在稀盐酸的存在下。胃蛋白酶必须有稀释的盐酸，并必须在37°C孵育最有效的工作。胃蛋白酶是一种蛋白水解酶，它主要通过吃跨膜蛋白在磷脂膜上打洞。这就是为什么在胃蛋白酶孵育后旋流细胞是重要的——从细胞核中剪去剩余的磷脂膜和细胞质。该方法最困难的部分是优化胃蛋白酶消化。这必须对每种细胞类型都要这样做。与实体瘤细胞相比，诸如淋巴细胞等精细的单细胞需要更低的胃蛋白酶浓度和更短的孵育时间。消化不足不允许剥离所有细胞质。过度消化将开始降低核膜的活性。随后将执行一个优化过程。测试优化的最佳方法是在用PI染色后在荧光显微镜下观察细胞，以观察细胞核的状态。第三步是与相对浓缩的（2N）HCl孵育，这是所有方法中的一个常见步骤。这一步骤非常重要，因为它可以解离DNA，并使结合的类似物可用于抗体和相对较大的荧光色素。使用带有清洁剂（如吐温-20或Triton-X）的缓冲液可使所有物品都易于接近。

贡献：弗吉尼亚州Snell.

参考：

白色，R.A.，A. Pollack和N.H.A Terry（1994）与氯酰亚胺连续标记连续标记后的单倍增肿瘤和相关二倍体细胞的同时细胞因子测量。细胞测定法15：311-319。

白色，R.A.和N.H.A Terry（1992）一种评价使用单克隆抗体对溴酰基脲酰胺获得的双抗体流式细胞术数据的定量方法。Cytometry 13：490-495。

Terry, N.H.A, R.A. White, M.L. Meistrich, and D.P. Calkins(1991)利用培养细胞测定群体潜在倍增倍数的流式细胞术方法的评价。血细胞计数12:234 - 241。

Terry, n.h.a.， R.A. White, M.L. Meistrich () Cell Kinetics: from Titriated Thymidine to Flow Cytometry BJR Suppl 24:153-157。

Terry, n.h.(1995)肿瘤细胞动力学参数在放射治疗中的预测价值:关于数据生产和分析的考虑。临床肿瘤学杂志13期1833-1836。

J.C.Carlton，N.H.A.terry和r.a.白（1991）使用流式细胞仪测量鼠肿瘤的潜在倍增时间。细胞计数12：645-650。

Pollack，N.H.A.Terry，C.S. Wu，B.M.聪明，r.a.白色和m.l.Meistrich（1995）在体内标记的肿瘤中碘氧氧基氨基的特异性染色：细胞动力学分析。细胞测定法20：53-61。

1. 将细胞用Brdutp（Sigma，St Louis，Mo，USA）以10μm的浓度标记60μm（时间可以根据细胞类型和培养条件而变化。）。
2. 细胞用冷HBSS清洗一次。
3. 将细胞沉淀重悬于2ml冷HBSS中，细胞悬浮液转移至60×15mm的聚苯乙烯培养皿（康宁NY，USA）。然后将菜肴直接置于FoTodyne UV 300分析DNA发烧器的玻璃表面上，含有四个15-W灯泡（Fotodyne，Inc.，New Berlin，Wi，USA），在300nm波长下提供最大照明。细胞暴露于紫外光5分钟。
4. 然后将细胞离心，固定在70％冰冷甲醇中并在4℃下储存长达四天。
5. 通过在PBS中洗涤两次来再水化细胞。
6. 细胞颗粒（约1 x 10⁶）被呈印迹以尽可能地除去所有无关紧要的上清液。将颗粒重悬于50μl的TDT反应缓冲液中含有：10μl5x缓冲溶液（1M钾的钾; 125mM Tris-HCl，pH 6.6; 1.26mg / ml牛血清白蛋白（BSA）;5μl25mm加入氯化钴;0.5μL（12.5个单位）的TDT（来自Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，美国）和0.25摩尔的Brdutp（Sigma）的TDT。
7. 细胞在37°C下孵育60分钟。在15 mM EDTA NaOH（pH 7.8）中洗涤细胞两次，停止反应。
8. 然后将细胞在100μl含有0.7μg缀合的抗Brdurd单克隆抗体（Becton Dickinson，San Jose，Ca，USA，克隆B44）的溶液中培养在100μl溶液中，0.1％Triton-X-100（Sigma）和1％BSA。用上述缓冲液洗涤细胞两次（减去单克隆抗体）。
9. 用5µg/mL PI在RNase存在下进行反染色(Li等等。，1995年，细胞测定法20：172）。

参考Li, X, Troganos, F.， Melamed, M.R, and Darzynkiewicz, Z.(1994)通过光解诱导的链断裂标记检测5-溴-2-脱氧尿苷(SBIP)。Int。j .杂志。4:1157 - 1161。

1. 培养条件和设备:
   
   • 用铝箔包裹的250毫升培养瓶
   • 25毫升ISCOVES中等
   • 10 mm Brdur.
   • 培养1E7在37℃下分离的细胞30分钟
     
2. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
3. 用2ml冰冷的70％乙醇固定颗粒。在4°C存储长达一个月。
4. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
5. 在4℃下加入2ml乙醇pH_TB 30分钟。
6. 加2ml PBTB。
7. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
8. 加入2ml PBS (pH 7.2)。
9. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
10. 加入250ml PBS（pH7.2）+ 20mg / ml碘化丙啶。
11. 测量BRDUR / DNA含量的FACSCAN上的细胞。

供稿人：Hans-Dieter博士Kleine

1. Ficoll骨髓根据以前的协议。
2. 将电池浓度调整为5 x 10⁴PBS中的细胞/μL。
3. 使用50µL的这种细胞悬液进行以下步骤或将上述数量与适当的数字相乘。
4. 用抗体对表面抗原的冰孵育30分钟：同种型对照制备与正常免疫蛋白型相同的方式。
5. 用2毫升PBS洗两次。
6. 将颗粒重悬于1mL PBS中，轻轻涡旋。
7. 在PBS中加入1 mL 2%冰冷多聚甲醛，同时漩涡样品(最终浓度1%)。冰中孵育1小时。用PBS洗两次。
8. 将颗粒重悬于1.9ml的0.9％甘盐水溶液中的颗粒。在冰上孵育30分钟，然后在正常盐水中加入0.1ml Tween-20 10％，涡旋轻轻。
9. 加入Hoechst 33343原液60µL(生理盐水100µg/mL)。在冰箱中孵育过夜。
10. 早上阅读flow上的样本。

G₀/G₁峰值应小于5％，只要荧光染料球在UV参数上产生的CV小于4％。散射和染色性能不应与新鲜染色样品显着不同。

1.根据以前的协议，Ficoll Bone Marrow。
2.将细胞浓度调节至PBS中的5×10 4个细胞/μL。
3.在以下步骤中使用50µL此细胞悬浮液，或将所有提及的量乘以适当的数字。
4.孵化30分钟的冰与表面抗原的抗体：同种型对照制备与正常免疫蛋白型相同的方式。
5.用2mL PBS洗涤两次。
6.将颗粒重悬于1mL PBS中，轻轻涡旋。
7.在PBS中加入1 mL 2%冰冷多聚甲醛，同时漩涡样品(最终浓度1%)。冰中孵育1小时。用PBS洗涤两次。
8.将颗粒重悬于1.9毫升PBS中。在正常盐水中加入0.1ml 10％Tween-20，涡旋温和。在冰上孵育15分钟。
9.在PBS中洗两次。
10.在50-90µL细胞悬液中加入10 uL的bcl-2 FITC (DAKO)抗体，冰上孵育15分钟。在相应的试管中加入10µL的同型对照。
11.在生理盐水中洗涤两次，重新悬浮在1.9ml的生理盐水中。
12.在冰上孵育30分钟。
13.在生理盐水中加入0.1 mL 10%的Tween-20，轻轻搅动。加入Hoechst 33343原液60µL(生理盐水100µg/mL)。在冰箱中孵育一晚，早上再测试样本。

1. 用不固定的溶解液溶解整个骨髓。轻轻地摇5-10分钟。
2. 旋转（1500 rpm / 5分钟）。请注意：如果颗粒中有红细胞，您可能需要再次添加裂解溶液1分钟。
3. 用温培养基洗涤细胞（RPMI 1640 + 1 mm HEPES，+ 2％FCS + PEN / STREP）。
4. 计算单元格数。
5. 用2.5 × 10的培养基做细胞悬液⁶细胞/ ml。
6. 将1毫升该细胞悬液等分放入以下试管中：
   
   ＃1）IgG1-FITC / IGG1-PE / IgG1-TC
   
   ＃2）IgG1-FITC / IGG1-PE / IgG1 + IgG2A-GAM-TC
   
   #3) IgG1-FITC/ IgG1-PE/ lineage - gamma - tc
   
   #4) CD45-FITC/ IgG1- pe / IgG1+ igg2a - gamma - tc
   
   ＃5）IgG1-FITC / CD38-PE / IgG1 + IgG2A-GAM-TC
   
   将这些管放在冰上以染色以进行补偿。
   
   
7. 将4 mL细胞悬液分装到以下试管中:
   
   X4 #6 (a, b, c, d) cd34-fitc / cd38-pe / lineage - gamc - tc
   
   X3#7（A、B、C）CD34-FITC/CD95-PE/LEVICE-GAM-TC
   
   X1 #8) (IgG1/4E3)/ CD34-PE/ lineage - gamma - tc
   
   X1＃9）（IgG1 / 4E3）/ CD34-PE / CD38-TC
   
   将Hoechst染料以每4毫升20μl添加。在黑暗中在37℃下孵育90分钟。
   
   
8. 从步骤5和6.用冷缓冲液（HBSS + 1mm Hepes + 2％FCS + PEN / STREP）洗涤1倍。
9. 将颗粒重悬于100μl冷洗涤溶液中。将管子＃1和9放在冰上。将51μl谱系鸡尾酒加入适当的管：
   
   谱系鸡尾酒由以下抗体组成：
   
   CD61 CALTAG 1 UL每次测试CD56 CALTAG5μL
   
   CD16 CALTAG 1 UL CD33 BD5μL
   
   CD10 CALTAG 1 UL CD66B IMMUNOTECH5μL
   
   CD19 Caltag 2 uL CD4 Immunotech 10µL
   
   CD11B CALTAG 2 UL CD8免疫电解5μL
   
   CD41 CALTAG 2 UL CD22免疫图5μL
   
   CD13 CALTAG 2 UL GLYA DAKO5μL
   
   对照试管中分别加入来自Caltag的纯IgG1和IgG2a各3µL。
   
   
10. 在冰上培养细胞15-30分钟。用2-3毫升冷缓冲液洗1次。将颗粒重悬于100µL冷缓冲液中。每管加入10µL γ - tc。冰中孵育15-30分钟。在补偿管中加入2µL的γ - tc。用2-3毫升冷缓冲液洗1次。
11. 将颗粒重悬于80μl冷缓冲液中。加入20μl鼠标血清。在冰上孵育15分钟。小鼠血清阻断了GAM上的任何游离受体位点，并且在GAM之后用其他小鼠抗人抗体染色时是必要的。用2-3mL冷缓冲液洗涤细胞1x。
12. 再悬浮颗粒100µL。向第8和9号试管中加入100µL的额外缓冲液。将这些试管分裂成两个额外的试管(A和B)。将5µL IgG1-FITC加入到试管A和5µL 4E3-FITC (Signet)到试管B。加入适当的其他直接结合抗体。孵育15-30分钟，用2-3毫升冷缓冲液洗1次。
    
    分体式管：
    
    #8A）IgG1-FITC/CD34-PE/LEVICE-GAM-TC
    
    ＃8B）4E3-FITC / CD34-PE / Lineage-GAM-TC
    
    # 9) IgG1-FITC / CD34-PE / CD38-TC
    
    ＃9B）4E3-FITC / CD34-PE / CD38-TC
    
    
13. 将颗粒重悬于4mL冷缓冲液中。在4°C存储直至排序。

单击下面的红色加号以查看每个项目的标准操作程序。

遵循用于细胞周期分析的相同方案。凋亡的细胞群将具有与活细胞相同的RNA含量，但将具有亚G₀/G₁DNA含量。

按照用于细胞周期分析的相同方法。细胞凋亡群体将具有亚G₀/G₁DNA直方图的DNA含量。

细胞凋亡试剂盒(Nexins Research B.V， #A700)188bet体育网址

该方案是通过附睾V-FITC结合同时检测表面标志物和磷脂酰丝氨酸曝光。

1. 该步骤仅适用于患者样品，不需要培养的细胞。Lyse外周血或骨髓，具有非混凝剂裂解溶液，根据方案。
2. 该步骤仅适用于患者样品，不需要培养的细胞。在冰上孵育在15mL 0.9％含有5mM EDTA（pH7.4）的盐水中孵育细胞15分钟。这释放出与PS结合的任何内源性膜蛋白v，以及释放有助于误阳性的结合血小板。用冷PBS洗一次一次。
3. 等分试样细胞进入适当标记的管，以根据适当的方案染色PE和/或PERCP或TRI缀合的表面标志物。
4. 用冷PBS洗一次一次。印迹颗粒非常良好地除去上清液，以免破坏待加入结合缓冲液的钙浓度。
5. 向颗粒中添加200µL的结合缓冲液（约10⁵-10⁶总细胞）。加入2μL膜蛋白V-FITC并在冰上孵育10分钟。保持管蛋白的管，并使用细胞的自发荧光作为流量的阴性对照。直接阅读样品。
6. 可选的：以5μg/ ml的终浓度为附睾/结合缓冲溶液添加碘化钛（股票：100μg/ ml）。在冰上孵育10分钟并直接读取流动。

特殊考虑因素：
只有新鲜的样本用于自发凋亡，不过夜存储或使用冷冻细胞。不要固定或渗透细胞，因为这会导致假阳性，因为PS暴露在细胞膜的内部小叶上。在膜联蛋白V染色过程中，结合缓冲液的使用是至关重要的，因为膜联蛋白需要一个生理浓度的钙来结合。或者，也可以使用细胞培养基或HEPES缓冲液，因为它们含有与结合缓冲液相同的钙水平。不要使用超过4周的binding buffer，因为它可能会导致假阳性结果，可能是由于pH值问题。最好使用碘化丙啶来区分坏死细胞(假阳性)和凋亡细胞。

贡献：Oliver Kliche博士/弗吉尼亚州Snell

参考：

Fadok VA，Voelker Dr，Campbell Pas，Cohen JJ，Bratton DL和Henson PM（1992）临床淋巴细胞表面上的磷脂胺暴露触发巨噬细胞的特异性识别和除去。J免疫素148,2207-2216。

1. 可选的：对于表面标志物染色，具有所需表面标记的染色细胞和适当的同种型对照30分钟的冰上。用PBS洗一次。
2. 固定：将一个部分2x PBS与一个部分2％甲醚混合（甲醇）。在轻轻涡旋的同时缓慢加入1％多聚甲醛至细胞。在4℃下孵育至少一小时。如果使用PE-CY5串联缀合物作为表面标记，则如果细胞保留在1％多聚甲醛直至TUNEL程序中，则达到最佳结果。
3. 用4mL PBS洗2次。
4. 渗透:如未进行表面标记物染色，用70%冰乙醇固定细胞，同时轻轻旋转。电池可在-20°C的70%乙醇中储存两周或更长时间。如果使用表面标记，最好的结果是通过Triton-X渗透细胞膜。将500µL 0.1% Triton-X重悬于PBS中，轻轻涡旋。冰中孵育15分钟。用4毫升冷PBS洗两次。
5. 计算样本的数量。制作足够的缓冲液，至少比实际样品多一个。加入适量生物素-16- dutp和TdT酶缓冲液(配方如下)。向细胞中加入40µL的反应缓冲液。对照反应为不加TdT酶的缓冲液加生物素-16- dutp。37°C孵育试管1小时。用4ml PBS洗涤细胞两次。
6. 制备足够的抗生物素混合物，至少比实际样品数量多一个样品（配方如下）。向样品中添加100µL的抗生物素混合物。在室温下黑暗中培养30分钟。用4毫升PBS清洗两次。
7. 将PBS中的细胞重悬于流式细胞术中。
8. 可选：用于细胞循环分析，将碘化物升至终浓度为5μg/ mL。在室温下在黑暗中孵育30分钟。在流式细胞仪上阅读。

   Tunel Buffer.

   • 20μl5x缓冲液
   • 10μl10xcocl
   • 70μldh.₂O

   TUNEL缓冲反应混合物

   TDT反应混合

   • 40µL TUNEL缓冲液
   • 0.6μl生物素-16-DUTP
   • 每个单独样品0.3μlTDT酶

   控制反应混合物

   做新鲜。

   • 40µL TUNEL缓冲液
   • 0.6μl生物素-16-DUTP
   • 每个样品100µL缓冲液

   逃亡者

   逃生素缓冲

   过滤并储存在4°C。

   • 4x SSC.
   • BSA 1% (w / v)
   • 添加列表项

   抗生物素蛋白混合

   做新鲜。

   • 100 uL亲和素缓冲液
   • 1 ul vidin fitc（Becton dickinson）
   • 每个单独样品0.5％Triton-x 100
   笔记：5x缓冲液，10x COCl，TDT酶和生物素-16-DUTP来自Boehringer Mannheim。

1. 可选，表面染色：使用PE和/或TRI / PERCP颜色单克隆抗体使用标准表面染色方案染色细胞。
2. 将细胞在PBS（pH7.4）中用2ml 1％多聚甲醛固定在4℃下15分钟。用PBS洗两次。可以储存在4°C。
3. 离心机样本。在PBS中再水化颗粒。离心机。去除上清液，吸干颗粒。
4. 将细胞重悬于50μl含有0.2m钾的Cacocothatellate，2.5mM Tris-HCl（pH6.6），2.5mm COC1中₂0.25 mg/ml BSA, 7单位Tdt, 0.5µM biotin-16-dUTP。细胞在37℃孵育1小时。用PBS洗两次。去除上清液，吸干颗粒。对照管重悬在没有Tdt酶的缓冲液中。
5. 将颗粒重悬于由4X SSC制成的缓冲液100µL, 0.1% Triton X-100, 1% BSA和2.5µg/mL avidin FITC中。室温黑暗中培养30分钟。用含0.1% Triton X-100的PBS清洗细胞两次。
6. 可选，用于DNA：用500µL PBS重悬细胞。加入100µL的Hoechst 33342 stock(10µg/mL in PBS + 10% Tween 20)，最终浓度为0.5µg/mL。4°C孵育8小时。

TUNEL技术仍然是细胞内凋亡的凋亡的黄金标准，尽管检测到较早期的细胞凋亡阶段的新方法可用。这种方法直接相当于Tunel技术，除了Brdutp代替Biotin-DUTP的事实。Brdutp比生物素-UTP昂贵几乎三个数量级，实际上几乎是比生物素-UTP强度更亮的原点。

1. 在所需的治疗或培养条件下，在汉克的缓冲盐水溶液（HBSS）中沉淀并固定在1％甲醇 - 无甲醛（Polysciences，Inc.，Warrington，Pa，USA）中，在冰上15分钟。将细胞离心并用HBSS洗涤一次。
2. 然后将细胞沉淀用冰冷的70％乙醇后固定，并在-20℃下储存长达4天。
3. 通过在PBS中洗涤两次来再水化细胞。
4. 细胞颗粒（约1 x 10⁶）被涂抹以尽可能地除去所有无关紧要的超值。将沉淀重新悬浮在末端转移酶反应的50微升缓冲液含有：10μL5X缓冲液（1M二甲胂酸钾的; 125毫摩尔Tris-HCL，pH值6.6; 1.26毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）; 25毫钴的5μL氯化物; 0.5微升（12.5单位）的TdT的（都来自Boehringer Mannheim公司，印第安纳波利斯，IN，USA），和BrdUTP 0.25纳摩尔（Sigma）的溶液。
5. 细胞在37°C孵育60分钟。用15mM的EDTA-NaOH (pH为7.8)洗涤细胞两次即可停止反应。
6. 然后将细胞在100μl含有0.7μg缀合的抗Brdurd单克隆抗体（Becton Dickinson，San Jose，Ca，USA，克隆B44）的溶液中培养在100μl溶液中，0.1％Triton-X-100（Sigma）和1％BSA。用上述缓冲液洗涤细胞两次（减去单克隆抗体）。
7. 如上所述，细胞在RNA酶存在下用5μg/ ml pi染色（Li等等。，1995年，细胞测定法20：172）。

流式细胞术用不同方法检测凋亡细胞的DNA链破裂标记。DNA含量与DNA链中的等距分布（等距轮廓图）与DNA链中断标记，其孵育的次数生长的HL-60细胞用0.15μm的喜树碱孵育3h，其优先诱导通过S期进展的细胞的细胞凋亡（AP）（Del Bino等等。, 1991)。左边的前三个面板代表了间接标记DNA链断裂，利用BrdUTP、地氧合dUTP (d-dUTP)或生物素化dUTP (b-dUTP)。右边的两个面板显示了直接的，单步DNA链断裂标记后的细胞分布，要么用BDIPY，要么用FITC结合的dUTP。注意纵坐标的指数尺度。显然，在BrdUTP标记DNA链断裂后，凋亡细胞与非凋亡细胞的分离达到了最大程度。

参考：用BrdUTP标记DNA链断裂。细胞凋亡和增殖的检测。(1995)李晓明和达兹凯维奇。细胞增殖28:571 - 579。

在幻灯片上的Tunel测定（apoptag.®加适用于[1cm x 1.5 cm面积])

固定

1. 使用Bd裂解溶液在4℃下固定细胞10分钟（1.5％甲醛）。
2. 在PBS中洗涤细胞1x，干燥，在-20℃下冻结。
3. 在室温下幻灯片。
4. 固定在3：1甲醇的混合物中：乙酸5分钟。
5. 添加约40µL平衡缓冲液（使用盖玻片）。培养至少30分钟。
6. 施加工作强度TDT（含有19μl反应缓冲液的混合物和8μLTDT酶。涡旋阱在微量离心管中。将载玻片孵育在37℃下1小时。
7. 用PBS洗涤3倍，每次3分钟。

检测

1. 添加工作强度抗体溶液（19μL阻断溶液的混合物和16μL抗番茄酮 - 荧光素。涡旋井在微量离心管中。在黑暗中孵育幻灯片一小时。
2. 用PBS洗3倍。
3. 用DAPI占有（通过混合1μl/ 50ml储备溶液，加入H.₂O)，将玻片盖上，静置1-2分钟。
4. 用自来水洗涤滑动并用空气擦干。
5. 在每个幻灯片上涂上一滴避光（Vectashield）并盖上盖板。
6. 使用60倍镜头检查显微镜下的幻灯片。

贡献：Katharina Cr Clodi博士

描述

PhiPhiLux是半胱天冬酶-3的七肽底物，含有两种罗丹明，在底物裂解时会发出荧光。当用488 nm激光激发时，发射最大值=530 nm（Fl1）。

试剂

• Phiphi Lux Reagent（Oncoimmunin，Inc。，大学公园，MD）
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
• 碘化丙烯酸铅

过程

1. 转移3-5 x 10⁵细胞到流式细胞术管。
2. 用PBS洗涤两次的洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于残余PBS中。
3. 加入5μLPhiphiLux试剂，并在37℃下孵育1小时。
4. 用冷PBS清洗。
5. 重悬于0.5mL冷PBS中的细胞，并加入1μl2mg/ mL碘化碘化物，用于活池门。
6. 流程分析：在Fl1上测量PhiPhi Lux荧光。有caspase-3活性的细胞比没有活性的细胞有明显更高的Fl1荧光。

贡献：伊琳娜斯蒂努夫和道格拉斯威德纳

试剂

• CMX-ROS（MITO跟踪器红色，分子探针，尤金或）
• DMSO溶液
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

CMX-ROS试剂制备

将试剂在50μg等分试样中供应作为冻干粉末。通过将94μLDMSO加入冻干粉末并储存在-20℃下，制备1毫米的原料。在染色之前，将该股票稀释至30nm的浓度为30nm，在染色之前将其温热至37℃。

过程

1. 转移3-5 x 10⁵细胞到流式细胞术管。
2. 用PBS洗涤两次的洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于残余PBS中。
3. 在37°C下加入300-500μl30nm cmx-ros / rpmi。
4. 在37°C下培养细胞1小时。
5. 用冷PBS洗涤颗粒细胞。
6. 最终细胞颗粒中加入500µl PBS，冰敷至流动分析。
7. 流程分析：测量FL3上的CMX-ROS荧光（EM MAX = 599 nm）。具有线粒体膜电位破坏的细胞显示为具有降低的FL3荧光的明显峰。

贡献：伊琳娜斯蒂努夫和道格拉斯威德纳

参考：男子气概等等。，cytometry 25（1996），333

在高线粒体膜电位的存在下，JC-1形成所谓的“J-聚集体”，其具有590nm（FL 2）的FL发射最大。当线粒体膜电位破坏时，如在凋亡期间发生时，JC-1成为单体，单体的发射MAX为525nm（F1）。因此，F1从红色到绿色的偏移表明线粒体膜电位的损失。

试剂

• JC-1（分子探针，尤金或）
• DMSO溶液
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

JC-1试剂制剂

试剂以5mg为单位以固体形式供应。通过将1ml DMSO加入固体JC-1并储存在-20℃下，制备5mg / mL的股票。在染色之前，将该股票稀释至PBS中5μg/ ml的工作浓度为37℃。[5 mg / ml = 7.7 mm]

过程

1. 转移3-5 x 10⁵细胞到流式细胞术管。
2. 用PBS洗涤两次的洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于残余PBS中。
3. 加入300-500μl5μg/ ml JC-1。
4. 在37℃下孵育细胞10分钟。
5. 用冷PBS洗涤颗粒细胞。
6. 最终细胞颗粒中加入500µl PBS，冰敷至流动分析。
7. 流程分析：测量FL1和FL2荧光。当绘制FL1 VS FL2时，具有线粒体膜电位的破坏的细胞显示为明显的绿色偏移群体。

贡献：Douglas Weidner.

参考：Salvioli.等等。，Febs Lett 411（1997）77-82

单击下面的红色加号以查看每个项目的标准操作程序。

试剂和抗体

• 美国公共电视台
• 100%甲醇
• 多甲甲醛
• Lysolithin（L-α溶血磷脂硫氨酸）（Sigma＃L-4129）
• nonidet（np40）（sigma＃n3516）
• RNase（沃斯汀顿生物化学公司＃LFO-5679）
• 牛血清白蛋白(BSA)分数V (Sigma)
• 碘化丙啶(Sigma # P-4170)
• 抗PCNA（Boehringer Mannheim生物化学＃1170406）
• 山羊抗鼠FITC（GAM-FITC）（Becton Dickinson#9031）
• msigg1同种型控制（100次测试）（Coulter＃6602872）
• 多甲甲醛 - 溶血素溶液（制作新鲜）：
  • 20-40μg/ ml溶血霉素
  • 1％的PBS中的多聚甲醛，没有CA和MG

过程

1. Pellet 1 x 10⁶细胞，并在冷PBS中洗涤2次。使用1.5毫升聚丙烯Eppendorf管。
2. 将颗粒在1ml多聚甲醛 - 溶血蛋白溶液中孵育2分钟。
3. 旋转（4000rpm 1.5分钟），吸出上清液和涡旋轻轻，以防止断裂细胞。
4. 用1ml 100%冰冷的甲醇在冰上孵育颗粒5分钟。
5. 旋转，吸出上清液和涡旋。
6. 将颗粒放入1mL 0.1%的NP40中，置于不含Ca和Mg的PBS中，冰上孵育5分钟。
7. 旋转，吸出上清液和涡旋。
8. 将细胞与1μg（1μl）的抗pcNA单克隆抗体在100μlpbs中稀释，在室温下30-60分钟。使用与同种型对照相同的IgG1（5μLIgG1）的IgG1（5μLIgG1）。
9. 轻轻旋转，吸出上清液和涡旋。
10. 用0.5 mL含0.1% BSA的PBS洗涤。
11. 加入1000个单位（10μl）RNase和0.5ml碘化丙锭（PBS中50μg/ ml）。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA.
• nonidet（np40）
• 70%甲醇
• 多甲甲醛
• rnase.
• PI.

抗体

• MsIgG1同型控制，未共轭(Coulter #6602872)
• ki-67 unconcated（达科#m722）
• 山羊抗鼠FITC（GAM-FITC）（Becton Dickinson#9031）

过程

1. 颗粒10.⁶细胞，加入1ml多聚甲醛（PBS中1％）并在室温下孵育5分钟。旋转下来。
2. 加入1ml 70％冰冷甲醇，在-20℃下孵育5分钟。旋转下来。
3. 加入1ml NP40（0.1％在PBS中），在冰上孵育5分钟。旋转，用PBS洗涤两次。
4. 用50μLPBS稀释5μl的Ki-67单克隆抗体孵育细胞，在冰上60分钟。
5. 在冰上加入10μL稀释的10μLBAB-FITC，在冰上稀释30分钟。用PBS洗两次。
6. 加入500μl碘化丙啶（50μg/ ml）+ RNase（1000 u / ml），孵育1小时或过夜。
7. 读流。

试剂

• 3.54克NA.₂HPO₄在100毫升DDW中（缓冲液为0.2米）
• 1.37克₂宝₄在100ml DDW中（缓冲液为0.1米）
• 赖氨酸储备溶液：
  • 1.862g赖氨酸 - 盐酸盐50ml 0.2m na₂HPO₄
  • 将pH调整为7.4，0.1M NAH₂宝₄
  • 用DDW配制总容积为100毫升
  • 在4°C下储存
• 万甲醛股票解决方案：
  • 9毫升NA.₂HPO₄，19毫升nah₂宝₄，22毫升DDW，4g万全甲醛
  • 加热至60°C，加入2N NaOH直至溶液清晰
  • 将pH调整为7.4
  • 在4°C下储存
• 钠 - 荟牙（Sigma）

抗体

• IgG1 FITC (Becton Dickinson)
• Ki-67 fitc (dako # f788)
• 任何针对表面表位的pe标记单克隆抗体

过程

1. 制备PLP试剂：7.5毫升赖氨酸储备溶液+ 2.5ml万甲醛股票+ 21.4毫克钠 - 荟牙。这项工作解决方案七天内容。
2. 孵化10.⁶具有PE标记的表面标记的细胞（参见免疫表型方案）。用PBS洗两次。
3. 向细胞沉淀中加入1ml的PLP试剂，并在冰上孵育15分钟。
4. 向下旋转细胞，用PBS洗两次。
5. 加入10μLKI-67 FITC，用40μLPBS/ BSA（1％）稀释。准备同种型控制。在冰上孵育30分钟。用冷PBS洗涤两次。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA.
• nonidet（np40）
• 70%甲醇
• 多甲甲醛
• rnase.
• 碘化丙烯酸铅

抗体

• msigg1未审聚（Coulter＃6602872）
• P120单克隆抗体（Coulter）
• 山羊抗小鼠FITC (gamfitc) (Becton Dickinson)

过程

1. 颗粒10.⁶细胞，加入1ml多聚甲醛（PBS中1％）并在室温下孵育5分钟。旋转下来。
2. 加入1mL冰冷的70％甲醇，在-20℃下孵育5分钟。旋转下来。
3. 加入1ml NP40（0.1％在PBS中），在冰上孵育5分钟。旋转，用PBS洗涤两次。
4. 用2μlP120单克隆抗体孵育细胞，用50μlPBS稀释，在冰上60分钟。用PBS洗两次。
5. 在冰上加入10μL稀释的10μlGab_fitc，溶于90μLPBS/ BSA（1％）30分钟。用PBS洗两次。
6. 加入500μl碘化丙啶（50μg/ ml）+ RNase（1000 u / ml），孵育1小时或过夜。

单击下面的红色加号以查看每个项目的标准操作程序。

1. Ficoll骨髓根据以前的协议。
2. 将电池浓度调整为5 x 10⁴PBS中的细胞/uL。
3. 使用50μL该细胞悬浮液用于以下步骤，或者将所有提到的数量乘以适当的数量。
4. 用抗体对表面抗原的冰孵育30分钟：同种型对照制备与正常免疫蛋白型相同的方式。
5. 用2毫升PBS洗两次。
6. 将颗粒重悬于1mL PBS中，轻轻涡旋。
7. 在涡旋样品（最终浓度1％）时加入1ml 2％的2％2％冰冷的多聚甲醛。冰中孵育1小时。用PBS洗两次。
8. 将颗粒重悬于1.9毫升PBS中。在正常盐水中加入0.1ml 10％Tween-20，涡旋温和。在冰上孵育15分钟。
9. 在PBS中洗两次。
10. 在50-90µL细胞悬浮液中添加10µL bcl-2 FITC（DAKO）抗体，并在冰上培养15分钟。还向适当的试管中添加10µL同种型对照品。
11. 在正常盐水中洗涤两次，重新悬浮在1.9ml的正常盐水中。
12. 在冰上孵育30分钟。
13. 在生理盐水中加入0.1 mL 10%的Tween-20，轻轻搅动。加入Hoechst 33343原液60µL(生理盐水100µg/mL)。在冰箱中孵育一晚，早上再测试样本。

1. 从1.5 x 10开始⁶3.7ml锥形底部塑料试管中的白细胞没有上清液。
2. 将细胞固定在1ml 100％冰冷甲醇中，在轻轻涡旋的同时加入细胞。继续涡旋直至颗粒崩解。
3. 将细胞在-20°C下冻结到完全10分钟。
4. 添加50µL不含钙、镁、1%牛血清白蛋白和1%全羊血清的PBS。在室温下静置30分钟。偶尔旋涡。
5. 在PBS中加入50μl抗RAS抗体，在PBS中稀释1:98，1％BSA和1％整体山羊血清。在冰上孵育30分钟。
6. 用PBS洗两次，留下约50µL的上清。
7. 加入50μL酸型抗大鼠抗体1:10，用PBS，没有Ca，Mg，+ 1％BSA，+ 1％全山羊血清。涡旋并在冰上孵育30分钟。
8. 用1mL PBS洗涤两次，留下约50μL上清液。
9. 添加50µL Cappel GAM-FITC，用不含Ca、Mg、+1%BSA、+1%全羊血清的PBS按1:40稀释。在冰上黑暗中培养30分钟。
10. 用1ml PBS洗两次。
11. 加入250μL高纯化的RNase。在37℃下在黑暗中孵育30分钟。
12. 将250µL碘化丙啶（西格玛）直接添加到试管中。
13. 电池可储存在4°C，直到测量。

单击下面的红色加号以查看每个项目的标准操作程序。

MDR1表达

单一的颜色

1. 1 x 10.⁶将细胞重悬于100μl的PBS中，具有2μLMRK16（Kamiya，千橡胶，Ca）（小鼠IgG2a;1.0μg总摩摩）。纯的小鼠IgG2A（Caltag）与相同的浓度用于对照（100μl细胞悬浮液中10μl抗体）。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次，用330×g离心8分钟。
2. 使用2µL生物素山羊抗小鼠IgG2a抗体（美国伯明翰南方生物技术公司）（1µg总MoAb）将细胞颗粒重新悬浮在100µL PBS中。在冰上培养细胞20分钟。用冷PBS清洗一次。
3. 在100μlPBS中重悬细胞沉淀，用4μL链霉抗生物素蛋白与Red613（Becton Dickinson，San Jose，Ca）缀合20分钟。用冷PBS洗一次。
4. 在Becton Dickinson FACScan上通过流读取FL3上的蛋白表达(激发在488，发射在613)。

多色

1. 1 x 10.⁶将细胞重悬于100μl的PBS中，具有2μLMRK16（Kamiya，千橡胶，Ca）（小鼠IgG2a;1.0μg总摩摩）。纯的小鼠IgG2A（Caltag）与相同的浓度用于对照（100μl细胞悬浮液中10μl抗体）。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次，用330×g离心8分钟。
2. 使用2µL生物素山羊抗小鼠IgG2a抗体（美国伯明翰南方生物技术公司）（1µg总MoAb）将细胞颗粒重新悬浮在100µL PBS中。在冰上培养细胞20分钟。用冷PBS清洗一次。
3. 将纯山羊血清中的细胞重悬于纯山羊血清中10分钟的非特异性结合，或用5μLIgG2A（0.5μgmoAb）的100μlPBS。洗1x冷PBS。
4. 用100µL PBS重悬细胞颗粒，用链亲和素偶联到RED613 (Becton Dickinson, San Jose, CA)和期望的PE和FITC偶联抗体。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次。
5. 通过流直接读取样本。

笔记：为了分析样本，MRK16表达的直方图覆盖了对照的直方图。使用Kolmogorov-Smirnov（KS）统计评估荧光的差异，表示为D，其测量两个分布函数之间的差异，并产生从-1.0到1.0的值。该方法精确地识别荧光的小差异，可用于检测低水平MDR1表达。MRK16染色强度分类如下：阴性（D <0.10），暗淡（0.10 0.25）和明亮（D> 0.25）。

参考：

• C.P.莱思等等。（1995）多药耐药性（MDR1）蛋白表达与急性霉菌白血病中功能染料/药物流出的相关性，Multipameter流式细胞术语：不和谐MDR1- / Efflux +和MDR1 + / Efflux病例的鉴定。血液86（6）2329-2342。
• C.P.莱思等等。（1997）《老年人急性髓系白血病：多药耐药性（MDR1）和细胞遗传学评估区分了对标准化疗有显著不同反应的生物亚群。血液89（9）3323-3329。

1. 重新悬浮约1 x 10⁶100µL PBS。同型对照管中加入IgG2a-FITC 5µL，样管中加入4E3-FITC 5µL。
2. 在冰上孵育15-30分钟。
3. 按时用2毫升冷PBS清洗。
4. 在200-300µL冷PBS中重新使用小球进行FACS分析。

笔记：必须始终使用4E3运行同种型控制，以便Kolmogorov-Smirnov统计数据可以与MRK16一样（见上文）。D值大于0.15被认为是阳性的。可以容易地使用4E3-FITC来实现多色流动。

1. 将细胞浓度调整为1 x 10⁶RPMI中的细胞/ mL + 10％FCS在37℃。
2. 取500µL为起始点，在原试管中加入500µL新鲜温培养基。
3. 在以下条件下孵育2ml以上细胞液:
   
   5μg/ ml DNR
   5μg/ ml DNR +10μg/ ml维拉帕米
   10μg/ ml维拉帕米
   
   
4. 在不同的时间点需要500μl。离心机，在冷PBS中重新悬浮颗粒。洗涤1x，将颗粒重悬于250μl冷PBS中。
5. 立即读取流。

1. 1 x 10.⁶将细胞用维拉帕米（10μg/ ml）和罗丹明-123（0.5mg / ml）预孵育在RPMI + 10％Fcs 37℃。
2. 用培养基洗涤细胞两次。
3. 在没有罗丹明-123的情况下在存在或不存在MDR抑制剂如维拉帕米（10μg/ ml）中，重新悬浮细胞。
4. 立即测量等分试样，每15分钟进行一次测量后。

表面标记物（PE-和PERCP结合）的双重染色是可能的，并允许与某些细胞群相关。如果需要，应在染料流出之前对表面标记进行染色。

1. 在含有DIO（C2）3的10ml 37℃培养基中悬浮在终浓度为60ng / ml的培养基中。将样品在37°C waterbath中孵育30分钟。在4°C下旋转。将颗粒重悬于3毫升新鲜，温暖，无染料培养基中。将样品分成三个等分试样。将一个样品放在冰上，立即通过流动读取基线摄取。
2. 在剩余的两个等分试样中加入高达3ml的温热，无染料培养基。在最终浓度为1μg/ ml至一根管中以2.5μg/ ml，或pSC833（Sandoz Pharmaceuticals）的最终浓度加入循环孢素A（CSA，Sandoz Pharmaceuticals，Basel，Switzerland），以抑制p-糖蛋白泵。在水浴中在37℃下孵育90分钟。用培养基在4℃下洗涤细胞并将颗粒重悬于4℃培养基中。存放在冰上流动。
3. 对于多色分析，可以用所需的PE和PERCP /三缀合的抗体染色细胞，并在4℃下在培养基中洗涤。

笔记：DioC2在波长为488nm的波长下激发，发射在500nm处，因此在Becton Dickinson FacScan上读取FL1的流动。DIOC2优于罗丹明-123（RH123），用于P-糖蛋白（P-GP）的功能分析由于更紧密的峰值，并且由于仅通过P-GP泵送的事实，而RH123被其他多药电阻泵送蛋白质。当使用蛋白质功能的单色分析时，可以在流过之前10分钟以5μg/ ml的终浓度加入样品中的碘化丙啶，以区分从活细胞中死亡。通过使用Kolmogorov-Smirnov（KS）统计学在P-GP抑制剂的存在/不存在中分析覆谱直方图的荧光荧光差异来评估Efflux。d值> 0.25用于将壳体定义为流出阳性。

参考：

• C.P.莱思等等。（1995）多药耐药性（MDR1）蛋白表达与急性霉菌白血病中功能染料/药物流出的相关性，Multipameter流式细胞术语：不和谐MDR1- / Efflux +和MDR1 + / Efflux病例的鉴定。血液86（6）2329-2342。
• C.P.莱思等等。（1997）《老年人急性髓系白血病：多药耐药性（MDR1）和细胞遗传学评估区分了对标准化疗有显著不同反应的生物亚群。血液89（9）3323-3329。

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本实验基于细胞因子作为靶细胞表面受体的特异性配体的原理。

试剂

• 来自研发系统的荧光因子（直接共轭荧光色素或生物素共轭），包括氟因子洗涤液。
• 用于阻断实验的未标记细胞因子

过程

1. 体积为25µL的1e5细胞与10µL结合细胞因子在冰上孵育60分钟。加入氟因子后摇匀。
2. 用氟因素洗涤溶液洗涤两次。（用股票溶液用PBS稀释1:10）。
3. 使用生物素化氟因素时，加入10μlStreptavidin-Pe，在冰上孵育60分钟。
4. 在步骤2中洗涤两次。

作为对照，未标记的细胞因子在超过10 M的荧光细胞因子中使用:从等量的细胞开始，加入未标记的细胞因子，摇匀一周，在冰上孵育15分钟，加入氟化因子，如上所述进行。

双重标签

荧光/生物素化细胞因子的可用性提供了与其他表面标记一起染色的可能性。双染色遵循协议Bcl-2癌蛋白. 此外，可以使用碘化丙啶进行复染。

该方法遵循表面标记染色的原理。作为一个例子，描述了用抗体对人IL-3受体的标记。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA.
• IL-3受体抗体（由DNAX提供）
• IgG1同种型对照抗体（Coulter）
• 山羊抗小鼠FITC (gamfitc) (Becton Dickinson)

过程

1. 2e5细胞+ IL-3受体抗体，加入最终浓度为5µg/mL。在冰上孵育30分钟。
2. 用PBS洗涤两次。
3. 添加二次抗体：用45μlPBS-BSA（1％）稀释5μlGam-FitC，在冰上孵育30分钟。
4. 用PBS洗两次。

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FDG =荧光素 - 二β-半乳糖醇苷

将5mg溶于3.8mL DDW = 2 mm FDG。

1. 将细胞置于α - mem + 10% FCS +抗生素的培养基中，调节至10⁷细胞/ ml。
2. 将100μl细胞悬浮液放入FACS管中，孵育在37℃水浴中5分钟。
3. 加入100μL2mMFDG，将持续至37℃，在37℃下再次混合并再孵育1分钟。
4. 在冰上，加入1800μL冰冷等渗培养基（α-MEM + FCS +抗生素）;在冰上孵育60分钟。

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9.1a来自冷冻骨髓的正常CD34 +细胞的分离

1. 对于袋子里的正常骨髓：
   
   将袋子放入塑料拉链袋中。进入37°C水浴和快速解冻的细胞，直到斜坡。
   
   用70％乙醇擦拭袋子的端口区域，插入无菌端口适配器。
   
   尽可能快地尽快，使用具有至少18号针的30级或60-CC注射器，优选16尺，从袋中从袋中取出电池悬浮液。
   
   从注射器中移除针头并将20mL细胞悬浮液转移至50ml含有30mL温热（37℃）缓冲液的锥形管，同时轻轻旋转。立即离心。
   
   
2. 对于试管中冷冻的正常骨髓:
   
   使用4-5（5毫升）小瓶的工作。将小瓶放入塑料拉链袋中。将袋子放入37°C水浴和快速解冻的细胞，直到斜切。
   
   用70%的乙醇擦拭试管。
   
   将4-5小瓶的内容物转移到含有30mL温湿液的50ml锥形管，同时轻轻旋转。立即离心。
   
   
3. 小心地从管中取出上清液，因为颗粒可能没有紧密地包装。轻轻地刮管使颗粒松散。将每管灌满50毫升温缓冲液。轻轻搅动，使细胞与缓冲液充分混合。离心机。
4. 重复步骤3，但将来自两个管子的电池组合成一个。
5. 再悬浮颗粒在40毫升温缓冲液中。轻轻搅动细胞。如果有一个很好的单细胞悬液，细胞可以被涂片以去除死细胞和粒细胞。如果有可见的细胞“串”，悬浮液需要在37°C孵育，同时轻轻摇晃，然后离心。这需要重复，直到实现单细胞悬浮。
6. 在Ficoll上，将20 mL细胞悬液置于15 mL室温Ficoll上。1800转离心15-20分钟。
7. 从Ficoll中除去单核细胞层。用50ml锥形管中用冷缓冲液洗涤细胞。离心机。
8. 将所有试管合并到一个50 mL锥形试管中。用冷缓冲液填充至50 mL。取出一个小样本（小于100µL）以计数细胞。离心。
9. 去除浮层。轻轻刮颗粒。基于总细胞计数，添加Miltenyi推荐的冷缓冲器量。然后添加推荐的抗体量（用于间接MAC套件的溶液A1和溶液A2）。轻轻旋涡，使细胞和抗体充分混合。
10. 将细胞孵育在冰箱中15分钟。将管填充至50毫升冷缓冲液和离心机。用50mL冷缓冲液洗涤第二次。
11. 去除浮层。轻轻刮颗粒。根据细胞总数，加入默天尼推荐的冷量。然后加入推荐量的抗体(间接MACS试剂盒B溶液)。轻轻旋涡，使细胞和抗体充分混合。
12. 将细胞孵育在冰箱中15分钟。将管填充至50毫升冷缓冲液和离心机。
13. 去除浮层。轻轻刮颗粒。为细胞添加足够的冷缓冲液，给出最终的细胞浓度约1×10⁸VS柱和1x10的每毫升细胞数⁷对于RS列。
14. 用冷脱气缓冲液装载柱。
15. 在30μm尼龙网过滤器上过滤电池悬浮液。保留少量的细胞悬浮液并记录精确的质量保证和质量控制（QA / QC）。
16. 添加细胞悬浮液。根据Miltenyi的说明继续分离。如果需要更高的纯度，则在第二列上放置正馏分。
17. 保留少量最终分数并记录QA / QC的精确体积。

MACS缓冲

• 汉克的平衡盐水溶液（HBSS）-Ca⁺²，-mg.⁺²
• 0.5％BSA
• 0.6%柠檬酸葡萄糖抗凝剂-A式(ACD-A)(百特)
• 100 U /毫升肝素
• 100-200 U / mL DNase（必须在使用前直接添加）
• 过滤器灭菌和储存在4°C

笔记：分离冷冻骨髓的最重要任务是实现单个细胞悬浮液。这主要是在缓冲器中的DNase完成的。为此，您可能希望缓冲区中的200 / ml DNASE到FICOLL步骤。在去除单核层后，可以将浓度降低至100u / ml。我通常在整个过程中使用100 u / ml。同样，如果您发现您具有特别硬的样本，则可能会将DNASE增加到200 U / ml，但不高。在Ficoll后细胞仍然很冷是非常重要的。理想情况下，细胞在整个过程中会冷却，以保留细胞活力，但DNase的必要性抢先这种情况。

查看Miltenyi插入公司的信息。

9.1b正常CD34的分离⁺细胞来自新鲜的动员干细胞

1. 重新使用样品，最多100毫升MACS缓冲液（见下面的配方）。等分到两个50毫升锥形管中。以1000 rpm的转速离心10分钟，使颗粒“软旋”。软旋转使浓缩在单球样本中的血小板保持在上清液中。血小板导致样品染色以及样品通过磁性柱的运行出现重大问题。由于颗粒是松散的，因此必须吸出而不是倒出悬浮剂。
2. 如果来自软旋转的上清液仍然相对浑浊，则可以重复柔软的旋转。
3. ACD-A改变了Pheresis样品中细胞的密度，使得粒细胞将保持在Ficoll的相互作用处。虽然Pheresis样品具有高浓度的粒细胞，但在激活之前除去血小板是更重要的。替代方案可以是样品最初悬浮在没有ACD-A的缓冲器中，然后是归良的。然后可以将单核层重悬于具有ACD-A的缓冲液中，并且进行软旋转。我们发现最好不要留下粒细胞并调节抗体的浓度（如下）。
4. 计算单元总数。将样品组合成一个50 ml锥形管。Miltenyi根据细胞总数列出抗体量;然而，这可以根据分类参数的阳性数量的估计来调整。由于Peresis有1-10％CD34⁺细胞，我们通常使用50%的推荐量的抗体。如果不进行Ficoll，可以将其降低到抗体量，但缓冲液不应低于此量，且潜伏期应延长至30分钟。加入Miltenyi推荐的缓冲液量。加入适量试剂A1，轻轻摇匀。加入推荐量的A2试剂，轻轻摇匀。在冰箱中孵育15分钟，定期轻轻摇动样品。
5. 用50ml MAC缓冲液洗涤样品两次。
6. 将样品重新悬浮在推荐的缓冲液中，并_试剂B的量，轻轻摇动。在冰箱中孵育15分钟，定期轻轻摇动样品。
7. 用50ml MACS缓冲液洗涤样品一次。
8. 将样品重新悬浮在至少10毫升脱气（见注释）MAC缓冲器1 x 10中⁹总细胞，或高达20毫升2 x 10⁹总细胞。在VS正选择列上运行样品。
9. 用3ml脱气缓冲液洗涤2x。
10. 将停止旋塞和注射器连接到VS列的底部。从磁铁中取出柱。带有6ml脱气缓冲液的反冲柱。更换磁铁中的柱。
11. 删除停止公鸡。允许缓冲区流过列。用3ml缓冲液洗涤2x。
12. 从磁铁上拆下磁柱。向列中添加6 mL缓冲液，并让其通过。向色谱柱中添加6 mL缓冲液，并插入色谱柱。
13. 计算从每个馏分中收集的细胞总数，以计算分离的回收率。
14. 用CD45-FITC和CD34-PE对收集的馏分进行流式细胞术(Becton Dickinson)评估样品纯度。

MACS缓冲

• 汉克的平衡盐水溶液（HBSS）-Ca⁺²，-mg.⁺²
• 0.5％BSA
• 0.6％抗凝血剂柠檬酸葡萄糖 - 公式A（ACDA）（Baxter）
• 过滤器灭菌和储存在4°C

笔记：运行仅使用脱气缓冲区的磁列时非常重要。去缓冲液，将100ml缓冲液放入150ml瓶中。将橡胶塞放在瓶子的口中附着在真空管线上。转动真空。将缓冲液在室温下脱涂至少30分钟。更换瓶盖和冷藏缓冲液直至冷。按照指示使用缓冲区。

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1. 电池在甲醇:醋酸中固定2X, 3:1，放在载玻片上。玻片的预处理对于淋巴结细胞或其他组织的制备是非常重要的。
   
   2分钟2X SSC
   5分钟triton-x / hcl
   5分钟PBS
   5分钟PBS / MGCL₂（%mL百万毫克）₂+ 95毫升PBS）
   甲醛5分钟1％（1.35ml 37％甲醛+ 48.7ml mgcl₂/ PBS）
   5分钟PBS
   乙醇系列（70％，85％，100％）
   风干幻灯片
   
   
2. 探针鸡尾酒：7μlCEP缓冲液（想象定有焦化染色体）
   
   7号染色体1µL着丝粒探针
   2µL 3染色体(Cy3) (Oncor)
   
   漩涡良好。在73oC下变化5分钟。
   
   
3. 用70%甲酰胺/2X SSC加热科普林瓶至37°C。变性切片3分钟。立即将玻片放入冰镇酒精系列中，每次3分钟(70%，85%，100%)。
4. 过夜杂交。
5. 在Coplin罐内37°C温度下，在65%甲酰胺/2X SSC中清洗3 x 5分钟。
   
   1X 8分钟，在37°C下，2X SSC
   1x 5分钟4x SSC / TWEEN 20
   
   
6. 每个载玻片上的DAPI 1 mL占据占据占有1至2分钟。用正常的H轻轻洗净₂o和空气干燥。
7. 添加1滴抗褪色(vectasshield)和遮盖。
   
   杂交两晚。
   
   
8. 50%甲酰胺/2X SSC在42°C的Coplin瓶内洗涤5分钟。
   
   3x 5分钟0.1x SSC在60oC时
   在4倍SSC / 0.2％Tween 20 + 5％BSA中阻断非特异性结合
   1：200抗霉素 - FITC（载体抗体）
   1：200抗生物素生物素化
   
   
9. 所有抗体均在4倍SSC /吐温20 / BSA中稀释。
   
   服用FITC 30分钟
   
   
10. 洗3X 5分钟4X SSC/Tween 20
    
    抗亲和素FITC 45分钟
    
    
11. 洗3X 5分钟4X SSC/Tween 20
    
    艾凡纳 - FITC 30分钟
    
    
12. 洗3X 5分钟4X SSC/Tween 20
13. 每个载玻片上的DAPI 1 ml占据占据1至2分钟，用正常的H轻轻洗净₂o和空气干燥。
14. 添加1滴抗褪色(vectasshield)和遮盖。

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PCR条件

10µL反应中的1.0µg总RNA用于反转录。反应的二十分之一用于PCR反应。PCR反应的总体积为25µL。生物素标记的MDR1 A、B2-M A引物和TBR标记的MDR1 B、B2-M B引物的最终浓度为0.2µM、0.2 M dNTP、2.5µL 10X反应缓冲液和1.5 U.

1. 以200 x g旋转离心细胞。用PBS洗涤两次。
2. 将颗粒重悬于1.5ml PBS中。在轻轻涡旋的同时在PBS中加入0.5ml 4％多聚甲醛。在4℃下孵育15分钟。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 将4°C存储在PBS中的细胞长达一个月。

磷酸盐缓冲盐(PBS) (1X)

• 0.23g nah₂宝₄（无水，1.9毫米）
• 1.24 g na.₂HPO₄（无水，8.1毫米）
• 9.25 g NaCl (155mm)
  
  添加H₂o到900毫升
  
  如果需要，用1M NaOH或1M HCl调节至所需的pH（通常为7.2至7.4）。添加H₂o到1升。如果需要，过滤器灭菌。在4°C下无限地存储
• 175.3克氯化钠
• 88.24克柠檬酸钠
  
  加950 ml h₂O
  
  用5米HCL调整pH至7
  
  用H稀释到1升₂O
  
  室温下储存<1个月

EDTA（乙二胺四乙酸）0.5M，pH 8.0

溶解186.1g na₂-edta.^．2H₂o在700毫升水中搅拌。用10米NaOH调整pH至8.0，然后用H调节1升1升₂o和高压灭菌器。在室温下储存<1年。

在pH值调整到8之前，EDTA不会完全溶解。

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抗体要求：

• IgG亚型，FluidGM规定每个反应100微克（由于回收率低，不建议低于50微克）
• 无载体-无BSA，明胶¹或其他稳定剂;叠氮化物和甘油很好
• 流式细胞术或IHC的优选认证;如果单克隆并识别出表位的本地形式，蛋白质印迹抗体可以起作用

¹我们已经成功地体验了用明胶和BSA标记抗体（确实竞争金属加载的聚合物），但这些蛋白质的存在使得不可能确定在标记反应后回收多少IgG和每种抗体的金属原子的数量。必须用已知表达表位的细胞测定标记抗体的可用性。

Cytof的抗体标记

聚合物的镧系元素	抗体二硫键的部分减少
旋转聚合物管10秒。对于每一个Ab，溶解一瓶聚合物在95µLdbPCR管中的L-缓冲液。	如果任何抗体的体积为> 500ul，则开始浓缩50k旋转过滤器;如果含有甘油浓缩并用R缓冲液洗涤几次。
加5μl.db镧系元素溶液对聚合物溶液，通过移液70x（使用屏障提示）混合。
在37℃孵育> 30-40'。
***在抗体之前必须准备好镧系元素的聚合物***
等待15分钟，从抗体开始→	确定R-Buffer需要100ug总共需要400ULdb抗体。将R缓冲液加入离心器件（50k）并加入100ug抗体，通过移液混合。 →离心12,000g 7'。
	摒弃滤液,等待镧系元素+聚合物孵育。
聚合物孵育后
将200ul L-Buffer添加到3K旋转过滤器，将金属加载的聚合物（100UL）转移到旋滤器中。 以12,000g（12'）离心。
	制备4 mM TCEP:将8µL 0.5M TCEP溶液加入1mL R-Buffer中。
	加100微升db4mm tcep到抗体，移液管20x →在37oC孵育30'。***时机至关重要
加300μl.C-Buffer，离心机12'以除去游离金属。（如果在聚合物离心之前完成抗体的部分减少，请用AB停止离心和恢复）	加入300µL的C-Buffer以部分地减少抗体，并在12,000g持续7'℃下离心。 （这是为了清洗多余的TCEP，停止减少AB。）
在95UL重新悬挂镧系元素DB = 195.C-Buffer（残留应为<5UL）（吸移管20x，允许在等待抗体时孵育过滤器。）	再用400µL洗涤C-缓冲
	快速移动到下一步（组合聚合物和抗体）以防止重新氧化抗体。
聚合物与抗体的缀合
移液管30X，转移镧系元素（105UL）db）至50k过滤器含有部分减少的抗体。
用移液管轻轻混合，在37度孵育O.C对于60'（最多2小时）。
加入300μlW缓冲液和离心机。用400μLW缓冲液重复3次洗涤3次。@Centrifuge 7分钟，丢弃滤液
重新在W缓冲液中停留：残留量约为15µL；添加88µLdb = 188.（总数103UL - 纳米二玻璃2UL;金属含量的1UL + 999UL 2％HCL; 100ULdb在0.5ug/uL Ab稳定剂+0.05%叠氮化物中纺丝并重组)
抗体标记的测量效率
Nanodrop:测量抗体浓度(使用2ul)。(蛋白IgG)(W-Buffer空白)
摘要:在2%盐酸中稀释10倍至10-5．分析100 ul 10-5稀释。比较3个最高值的平均值与标准(1 ppb)。
抗体储存：离心抗体10'。在储存缓冲液或50％甘油中将抗体重新悬浮至0.5 Ug / UL。（注意〜15ul残差。）
聚合物旋转过滤器：PALL NANOSEP 3K OMEGA CAT＃OD030C35;离心装置：Millipore Amicon Ultra 0.5 ml 50k Cat＃UFC505096;镧系元素的工作浓度为50毫米

db如果结合200ug IgG，则增加一倍量/体积。

Adrienne Halupa–2010年11月（由Duncan Mak修改–2017年6月）

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• 根据需要刺激/抑制/治疗细胞（每个样品1×10 ^ 6个细胞）。
• 为了停止信号传导，将16%甲醛（PFA）直接添加到所有试管中（每管100微升，1:10）。
  • 在室温下培养10’。
  • 在4℃下以600克离心600克。
  • 吸气。用洗涤缓冲液（PBS-0.5%BSA-0.02%叠氮化钠）洗涤3次。
  • 该固定步骤是有问题的 - PFA可能会影响表面AB的性能。

• 注意每个样本的Ab混合物的体积，在35-40uL的染色缓冲液(0.5% BSA-PBS)中重新悬浮高达1.5M的细胞，加入Ab混合物(10-15uL)在RT下孵育30 ' -60 '。
  • 用1.5毫升洗涤缓冲液洗涤2-3遍。涡旋混合。

（使用1：500 rH103在PBS中为20min或25um顺铂的可行性染色1分钟）

• 在PBS中添加300-500微升1.6%甲醛至细胞颗粒，在室温下培养10'（或1h）。
• 旋转细胞，丢弃上清液。（无需洗涤，以最大限度地减少细胞损失。）
  • 在细胞上留下100μlPBS，通过涡旋分离颗粒。
• 通过加入冷100％甲醇渗透并在4℃下孵育10'（偏好-20℃，或者使用BD Fix / Pubs Buffer或其他已知在您的实验室中工作的其他渗透方法）
  • 每1×10 ^ 6个细胞加入0.9ml甲醇（最终为90％）（根据表位取决于50-90％甲醇）
  • 可选：在-20 c储存最多24小时，最多1个月IF -80 C.
• 用洗涤缓冲液洗涤2-4x。
  • BSA将提供ppt除非> 1毫升的洗涤缓冲液被添加-需要大于等量的甲醇!
  • 在最终洗涤后留在不到35-40ul的细胞

• 注意每种样品的AB混合的音量（10-15UL）
• 将移液管转化为35-40ul，占据每个样品管中的细胞，并用染色缓冲液（例如，从填充缓冲液的96孔板），弥补设定的体积，转移到新管。（染色浓度尤其是磷蛋白的物质）。
• 加入Ab混合物（10-15uL），使最终染色量正好为50uL，在RT下培养30'-60'。
  • 宁愿与温和摇动/搅拌/混合孵育。
• 用洗涤缓冲液洗涤2-3x。
  

• 添加0.5 ml 1:1000 Ir插层剂，在室温下用1.6%PFA在PBS中稀释至少30分钟（最好在4℃下过夜）。
  • 延长的ir染色，至少一个星期，如果没有仪器也可以工作
  • （如果不透化，染色细胞，含有1：500的IR-interpalator，在0.3％皂苷中，洗涤缓冲液，20'）在室温下）
• 用2ml洗涤缓冲液洗涤2x（计数并过滤最终洗涤，如果未进行进一步洗涤）
• 为了获得更好的仪器稳定性：用1mL的质量分数水清洗1x**，（如果起始细胞数大于1M，则计数细胞，对于单次注射400uL而言，0.5M是理想的）**一些细胞粘附在塑料上（无论是聚苯乙烯还是聚丙烯），在这一步中，可能会损失超过90%的细胞；用0.1%牛血清白蛋白在毫升水中代替。
• 过滤最终洗涤（通过蓝色管（35um），在残留体积（〜50ul）中留下细胞沉淀。
• Autosampler：（在50uL DIW中重新悬浮细胞颗粒）；向每个孔中添加50uL EQ珠，将细胞悬浮液转移到孔中（96个深孔板；注入前将添加>400uL缓冲液）。

Adrienne Halupa，多伦多大学- 2012年3月，DM修改2015年3月