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服务

DNA甲基化分析服务

概述

DNA甲基化分析设施由癌症表观遗传学中心和表观遗传学和分子癌变学系资助。它为所有MD安德森分校和德克萨斯医学中心的研究人员提供DNA甲基化分析相关服务。188bet体育网址服务包括:与调查人员协商，选择最佳的分析方法;最常用的基因特异性和全基因组的样品制备、分析设计和样品处理( PyroMeth，RRB和甲基-SEQ）DNA甲基化分析;开发和维持常用的测定库，以测量全局DNA甲基化（线，ALU）和常见的基因特异性试验（P16， e-cadherin.， MLH1, p15等)。该中心位于休斯顿MD安德森癌症中心的米切尔基础科学研究大楼。188bet体育网址我们拥有完备的分子生物学研究设备，并拥有Qiagen焦磷酸测序机。188bet体育网址

DNA甲基化分析的主要障碍是甲基化胞嘧啶不能简单地通过测序检测到。在PCR扩增过程中，甲基化的胞嘧啶不被DNA聚合酶分化，与未甲基化的胞嘧啶一样与鸟苷二核苷酸配对。因此，捕获甲基胞嘧啶依赖于间接方法。最常用的方法有(1)限制性内切酶法，利用甲基化敏感酶;(2)基于亲和的方法，其中针对5-甲基胞嘧啶或针对甲基结合结构域蛋白的抗体用于收集基因组的甲基化部分，以及(3)通过水解脱氨反应将非甲基胞嘧啶亚硫酸氢盐转化为胸腺嘧啶，它利用了甲基化胞嘧啶对游离羟基的不反应性。这些方法在表观基因组研究中都有重要的应用，并已单独或组合应用于单个基因和大规模分析。在这些方法中，亚硫酸氢盐转换是金标准，因为它与测序方法结合时分辨率高。通过这种方法，每个胞嘧啶都可以被确定为甲基化或未甲基化。

DNA甲基化分析工作流程

我们的工作流程始于研究人员提出的咨询和服务请求。188bet体育网址根据项目是调查特定基因的甲基化状态还是整个基因组，应用两种工作流程中的一种。

根据需要设计和优化候选基因测定。在进行亚硫酸氢盐处理之前评估DNA样品完整性和质量。然后进行治疗，并扩增特定的感兴趣区域和焦肌。

在全基因组研究中，还原亚硫酸氢盐测序(RRBS)应用于有关启动子和CpG岛的问题，而全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)用于回答更多的全球问题。一旦样品质量得到保证，它要么被酶消化，要么被声音剪成适当大小的碎片。然后在用亚硫酸氢盐处理之前连接到DNA末端。经过处理后，测序库将被准备好并进行质量检查，然后送往下一代测序设备。

咨询和生物信息学

选择合适的DNA甲基化分析方法取决于调查是否仍处于发现阶段，或者是否已经确定了一组目标。此外，在处理微量DNA或将DNA甲基化用作分子标记时，必须考虑有关分析设计和检测方法的特殊考虑。DNA甲基化分析设施将与研究人员合作设计分析和进行实验。如需安排咨询，请联系Marcos Estécio博士，电话：mestecio@mdanderson.org.

188bet体育网址涉及下一代测序服务的研究人员在计划详细的项目之前，应该总是咨询生物信息学家。对于生物信息学分析的帮助，MD Anderson用户可以咨询他们的机构指定的部门生物信息学专家，从Epicore主管寻求潜在生物信息学合作者的建议，或联系Arif Harmanci博士。UT Health的创始人电子邮件．

焦磷酸测序DNA甲基化分析

亚硫酸氢盐转化后，基因特异性的目标在PCR反应中被扩增，引物从甲基化和未甲基化等位基因中产生扩增子。在焦磷酸测序反应中对选定的CpG位点进行量化。该方法的优点是灵敏度高，具有中等到高通量的定量读取甲基化。

在右边的图像中，靠近基因转录起始点的区域手1基于先前的微阵列实验选择了用于测定设计。放大区域覆盖了四个CPG位点，其以黄色突出显示。在该实施例中，结肠癌细胞系RKO在所有检查的CPG位点（平均= 97％）显示出高水平的DNA甲基化，但在正常外周血淋巴细胞（6.3％）中相同的基因未甲基化。

酸性亚硫酸盐测序

与焦磷酸测序类似，在亚硫酸氢盐测序中，基因特异性靶点在PCR反应中扩增，引物产生甲基化和非甲基化等位基因的扩增子。通过Sanger测序对单个克隆产物进行测序，可以揭示几十个位点的甲基化状态，并识别等位基因特异性甲基化。

还原亚硫酸氢盐测序(RRBS)

RRBS结合了基于酶的方法和基于亚硫酸氢盐的方法，是当今最流行的全基因组方法之一，因为它能够容纳不同起始量的DNA。DNA用限制性内切酶消化，并根据大小进行选择。后转接器连接确保了CpG岛的富集。然后对DNA进行亚硫酸氢盐处理，并用通用引物进行扩增。检查生成的RRBS库的质量，然后将其转移到下一代测序设备进行最终处理。一般来说，在一次试验中评估了40万至100万个CpG场地。

该图像显示了前列腺细胞系RWPE-1和Du145的RRBS数据的基因组浏览器视图。每条竖线表示一个CpG位点的甲基化密度，范围从0%到100%。一个差异甲基化区域(DMR)重叠CpG岛出现在备选的转录起始点TP73基因。