方法和服务

非脱钙骨标本的处理/包埋/染色

Calcein标记的（1）骨架固定在10％福尔马林中，在4℃下不超过六小时，并通过项目调查人员向核心提供高达80％乙醇的脱水。根据实验模型（遗传修饰小鼠或注射骨骼的骨骼），将在4℃下溶解和脱水，在醇溶液中脱水至100％乙醇。骨骼的其余部分将被送回调查员。解剖标本将根据已建立的协议（2）加工。它们将在4℃下渗透到含有100ml不稳定的甲基丙烯酸甲酯（MMA），14mL壬基苯基 - 聚乙二醇乙酸酯（NPG）和0.33g无水苯甲酰基过氧化酯（BPO）的培养基中渗透两次。然后将样品在含有100mL MMA，14mL NPG，0.55g BPO和500mL N，N二甲基-P-甲苯胺99％的培养基中转移。聚合将在4℃下进行。

塑料块将在粉末/抛光机上修剪，并将在配备碳化钨一次性刀片的电动Leica RM2165 Mictotome上进行切片。将在定位块以确保所有标本在切片时具有相同的取向。将在注射小鼠（矢状部分）的骨骼中收集七微米部分，或直到达到转基因动物或其对照凋落物的椎骨中的三分之二。将选择一组10个连续部分，位于动物之间的同一平面中（＃1-10）进行分析。部分＃1-3和8-10（7微米厚）将与Von Kossa试剂染色，并通过Van Gieson方法归备，用于初步分析基本参数（3）。该程序染色黑色，骨质中的矿化骨基质，红色和细胞介质粉红色。4-7部分将以4微米厚度切割并留下未染色并储存以进一步分析。在特定的请求之上，并且在逐案的基础上，这些未染色的部分将用于进行细胞计数（成骨细胞，破骨细胞）和量化动态参数（BFR）。

为了定量成骨细胞数，根据标准方案（4），载玻片＃4将用甲苯胺蓝色染色。为了定量骨壳数，将＃5将进行酶测定，用于检测酒石酸耐碱性磷酸酶染色（捕集器）（4），该酶特异性地表达的骨髓内骨髓中的酶。然后将这些部分用褪色的苏木精染色。幻灯片＃6将被留下在荧光灯下的矿化前面的Calcein可视化。测量将在每个样本的一个幻灯片上的30-35个字段中执行。将检查样品中的所有幻灯片将用于避免的可能异常。

骨骼的分析

所有骨特异性参数将按照ASBMR组织形态计量学命名委员会(5)制定的准则以单位进行测量和表达。对于每个实验，实验和对照样本将同时进行分析。建议每组至少分析15只动物，以减少可能的遗传变异的影响。

分析长骨(即股骨、胫骨)或骨骼(下脊柱-特别是L3或L4骨活检，或颅骨)，我们将使用骨测量系统中现有的半自动模式来测量三个参数:

• 骨体积
  • 计算为小梁骨所占的总骨髓体积(BV/TV， %);骨体积应大于或等于测量面积的15%。分析可能需要一个以上的骨截面来获得足够的骨体积
  • 小梁的数量
• 评价骨小梁的数量在测量骨体积(Tb。N,毫米^－１）
  • 小梁厚度
• 作为存在于骨体积（Tb.th，μm）的测量领域内的小梁的平均厚度计算

这些参数将提供一个可靠的估计存在的增加或减少的骨量在实验标本。

从两个非相邻切片/载玻片获得的高倍图像中，对30-35个相邻视场进行细胞计数和动态组织形态测量。

单元类型和测量过程

造骨细胞是沿骨表面成团排列的立方细胞。破骨细胞成骨细胞/破骨细胞计数和动态组织形态测定法需要特定的染色来评估，并且可能是耗时的。这些服务可根据项目调查人员的要求执行。

造骨细胞可以使用甲苯胺蓝，HTX或Goldner 's Modified Trichrome染色最好的可视化。两种成骨细胞数量(N.Oc/BPm, mm^－１)和成骨细胞表面(obs /BS， %)数据将提供给研究者。

破骨细胞可以用TRAP酶染色最好地显示。破骨细胞数量(N.Oc/BPm, mm^－１）将向调查人员提供骨壳表面（Orteoclast表面（OC.S / BS，％）数据。

调查员收到数据

两个表征骨形成的动态参数将提供给研究人员。矿物链接率（MAR，MM / Day）将被测量为通过注射施用的两个不同的Calcein标签的中点之间的距离除以标记事件之间的时间间隔。通过添加双标签表面和单个标签表面并除以总骨表面来计算矿化表面（MS）。骨形成率（BFR / BS，MM^3./毫米²/日）通过将MS乘以MS来计算。

钙黄绿素注射的时间间隔如下:

• 大型动物10-14天
• 小动物2-7天;对于小型啮齿类动物来说，4天的间隔已经被证明是理想的