服务
先进技术基因组核心(ATGC)提供多种服务，包括:
附加服务
ATGC提供多项额外服务，包括:
- 数字PCR滴
- 荧光片段分析
- nanoString nCounter分析
数字PCR滴
液滴数字PCR (ddPCR)用于多种分析，包括核酸靶点的绝对定量、基因表达或罕见事件(突变)检测。Bio-Rad QX200系统使用荧光(探针或EvaGreen)和大小约为1纳米升的油水乳状液滴分离和分析单个液滴中的目标。该技术提供了非常灵敏的分析，非常适合于低频目标的检测。
查看服务定价时间表有关ddPCR定价．
微滴数字PCR应用
- 不使用标准曲线检测拷贝数变化
- 检测罕见突变或序列-在多达2000个野生型分子的背景中检测一个突变
- 进行基因表达和microRNA分析
- 执行单细胞分析
- 检测病原体，分析微生物组
- 定量NGS库并验证NGS结果
仪表
Bio-Rad QX200 ddPCR系统由一个液滴发生器组成，可形成约20,000个水油乳状液液滴，以及一个液滴读取器，用于计数每个液滴中的靶标。
ATGC的ddPCR服务是如何工作的
- 研究人员负责从Bio-Rad: http://www.bio-rad.com/en-us/product/primepcr-pcr-primers-assays-arrays购买定制或库存(验证)的分析和适当的主混合。
- 调查员安排了ATGC的仪器运行。
- 研究者在96孔板(Bio-Rad P/N 1864108首选)中设置Eva Green或taqman式探针反应，总容积为22ul。如果反应使用evgreen作为荧光载体，则必须在Bio-Rad 96孔PCR板(P/N 1864108)中进行。
- 研究者将反应在一个密封的96孔板中传递给ATGC的ddPCR服务。
- ATGC从研究者的反应中产生液滴。
- 样品从液滴发生器转移到96孔Bio-Rad板，密封并放置在热循环器中进行PCR。
- PCR扩增后，将样品放置在液滴读取器上，液滴被依次检查，类似于流式细胞仪，提供独立的数字测量。对于感兴趣的标记，液滴被标记为阳性或阴性。
- 数据输出-向调查者提供分析文件。研究者可以使用Bio-Rad的免费QuantaSoft™软件进行进一步的数据分析，该软件可在这里免费下载:http://www.bio-rad.com/en-us/SearchResults?Text=quantasoft&TabName=SOFTWARETYPE
微滴数字PCR提交
- 联系Denaha (D.J.)Doss (DJDoss@mdanderson.org)安排您的仪器运行。请至少提前24小时通知。
- 填妥“服务要求”及“餐盘布局”表格，电邮至:ddPCRSubmissions@mdanderson.org．联系ATGC索取表格。
- 在96孔板(Bio-Rad P/N 1864108优选)中进行反应，密封并离心。
- 如果在中午之前提交车牌，结果可以在当天得到。
ATGC联系信息
Denaha (D.J.)床铺
电子邮件:djdoss@mdanderson.org
埃里卡·汤普森
电子邮件:ejthomps@mdanderson.org
Bio-Rad支持试验设计或数据分析
电话:1-800-4-BIORAD (1-800-424-6723)
通过电子邮件:support@bio-rad.com
荧光片段分析
荧光片段长度分析用于确定基因型、评估杂合度损失和微卫星不稳定性。DNA片段分析允许一系列的应用，如病人
细胞系鉴定和非整倍体检测。这种技术涉及在扩增过程中使用荧光引物来标记PCR产物。然后用毛细管电泳分离这些产物。用户负责提供荧光标记的PCR产品，这些产品与3730基因分析仪上的尺寸标准一起运行。如检测基因组的多次重复片段，快速周转时间，具有更高的精度和分辨率，便于科学家选择片段分析。片段分析可以在一次运行中调查20多个基因座。多路复用能力;和基因座特异性引物的个性化重叠位点的等位基因使得片段分析技术有利可图和成本效益高。
查看服务定价时间表有关荧光片段分析定价的更多信息。
仪表
该设备在3730毛细管平台上进行分析。运行时间为两个小时，96个样品，750个基地大小。与传统方法相比，ABI (Thermo Scientific)基因扫描™平台有几个优势。这些措施包括运行单独的车道尺寸标准，以消除车道之间的迁移差异。该仪器还提供了更高的检测灵敏度，允许使用更少的DNA。当使用有限的肿瘤样本时，这一点非常重要。而且，基于pcr的检测易于标准化和自动化，所以结果非常可重复性。
这种分析的最佳尺寸是100-400个碱基。分析所用的尺寸标准是LIZ 500。请不要用LIZ染料给你的底漆贴上标签。
荧光片段分析步骤
1.良好底漆设计指南:
- 设计正向引物和反向引物，使引物具有可比的Tm。
- BLAST引物序列，以确保引物只有一个目标。
- 设计带尾的反向引物。这对于准确地调用等位基因非常重要，因为在PCR过程中，taq聚合酶随机地在模板的3'端加入一个腺苷。这通常被称为“+ A”现象。一种迫使“+ a”反应完成的方法是在反向引物的5 '端添加一个GTTCTT尾部。
- 这将减少由于试图区分+A等位基因和真等位基因而造成的数据解释困难。
- 此外，在70˚C的温度下添加30分钟的最终延伸，将促进“+ a”添加的完成。
2.通过氯化镁滴定和改变退火温度来优化PCR。
3.对PCR产物进行定量。即使只有0.5-1 ng的产品也会发出强烈的信号。同样重要的是要记住，太多的产品将导致CCD相机饱和，软件将不再能够纠正光谱重叠。这将导致所谓的“引体向上峰值”。
关键荧光片段分析因素
以下因素是成功检测小移动性因素的关键:
- 引物标记:Life Technologies (Thermo Scientific)推荐使用5'末端标记引物。请只标记其中一种引物。
- 尺寸标准:反应采用35-500 bp的内标。强烈建议PCR产物的大小在50-500 bp之间。软件分析片段长度所用的内部标准为LIZ(橙色)。因此，不建议用LIZ标记引物来合成PCR产物。
- 控制DNA:我们还建议您提交来自已知基因型的个人的PCR产物。这将有助于为客户提供故障排除和服务。它可以监测凝胶-凝胶的变化，并提供关于PCR扩增有效性的信息。
荧光片段分析常见问题
什么是GeneMapper™吗?
这是一款能够准确测定荧光标记PCR片段长度的软件。这项技术将允许在一个通道中多路复用许多不同的片段，因此允许快速筛选多个位点。该软件可以用来确定等位基因峰下的大小、高度和面积。这些信息可以用来确定特定等位基因STR的大小，是否显示微卫星不稳定或是否有等位基因丢失。
我可以用什么染料?
引物标签的选择包括6FAM, NED, VIC或PET。本实验室常用的多路复用器有NED, 6FAM和VIC。只有一种引物应该用荧光标记。引物应标记在引物的5'末端。定制工具包和预优化工具包可从生命技术。
微卫星是什么?
微卫星是在基因组中发现的信息丰富的标记。它们被定义为2 - 10 bp单位的串联重复，可以是完全重复或不完全重复，例如cagcagcag。重复区域在群体中具有高度的多态性，但在个体及其家族中往往是保守的，因此，作为信息分子标记。在每个个体中发现的重复数量是高度可变的，每个微卫星单元中只有两个或多达50个副本。最常用的微卫星标记是二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复序列。这些遗传标记可作为分子群体遗传学、医学遗传学、法医DNA研究和进化生物学等领域的重要研究工具。188bet体育网址
由于邻近的DNA通常是保守的，引物从DNA侧翼的微卫星区域构建。在PCR过程中，包含微卫星的区域被放大。荧光标记的PCR产物然后使用毛细管或凝胶电泳按大小分离。PCR产物的大小可以用来确定重复的数量。
多路复用是什么?
当每个PCR反应都用不同的染料标记并在仪器上运行之前混合，许多PCR产品可以在一个车道上运行和大小。这使得高通量微卫星筛选成为可能。在这一设施中，多达5个独立扩增的PCR产品已成功多路复用。商业工具包可提供多达10-16个位点可以多路复用。我们强烈建议您在提交大量样本时考虑多路复用。
多路复用的第二种选择包括将多个引物集与一个模板混合，同时共扩增所有产物。这需要更多的优化，因为在一个反应中，所有的标记可能不会以相同的效率放大。
什么是引体向上的高峰?
当PCR产物的信号过高时，仪器软件就无法对染料集存在的光谱重叠进行校正。理想的rfu值应保持在200-2000之间。这意味着在一个强峰的位置下会出现其他彩色的小峰。这将在数据解释中产生错误。提交本服务的PCR产物的浓度应为0.5-1 ng/µl。
提交样本的程序:
1.客户需要提交他们的纯度为0.5到1ng /ul的荧光标记PCR产品，在0.5ml试管或96孔PCR板中。PCR反应最常用的染料是6FAM, VIC, NED和PET。
2.客户需要向桑塔斯里·森(Santasri Sen, santsen1@mdanderson.org)女士发送一份包含样品名称和PCR反应中使用的染料的excel表格。
3.还需要将包含客户账户信息的完整账单表格发送给sen女士。表格可以从核心设施网站下载。
4.该设备为首次使用的用户运行一个优化板，在不同的稀释度下运行每个样品，以确定正确的稀释度，以产生可能的最佳结果，并避免拔峰。QC数据将发送给客户。
5.周转时间通常为24至48小时。
6.客户可以下载Peak Scanner软件来解释数据，该软件可从应用生物系统网站免费获得。该软件能够识别峰值并调整其大小。
nanoString nCounter分析
nanoString nCounter分析系统采用一种新型荧光彩色编码分子条形码技术，结合单分子成像来进行数字核酸(RNA和DNA)计数。这项技术使研究人员能够同时分析数百个靶点，在许多试剂盒的单一反应中多达800个mRNA或miRNA靶点。
查看服务定价时间表有关nanoString nCounter分析定价的更多信息。
系统亮点及应用
- 在单一反应(某些分析)中多重达到800个目标
- 最小/无扩增或酶促反应
- 利用小样品量(100ng RNA, 300ng gDNA)，联系D.J. Doss了解具体试剂盒要求
- 不同和困难的样本类型:血液，组织和FFPE衍生的样本，ChIP DNA
- 灵敏度高，重现性好
- 快速周转，有时只需4个工作日
RNA的应用程序包括:
- 复杂基因表达网络的靶向分析。
- 基因融合和剪接变异的特性。
- microrna的表达分析。
- miRGE分析(同时miRNA和mRNA)。
- LncRNA表达分析(定制顺序)。
DNA的应用程序包括:
- Illumina NGS数据的验证。
- 拷贝数变异分析。
- 芯片筛查(ChIP-String)。
仪表
该nCounter MAX/FLEX系统由用于样品处理的机器人nCounter准备站和用于采集数据的nCounter数字分析仪组成。
样品提交
NanoString提供各种预先设计的、现成的检测方法*。ATGC库存一些常用的分析(请询问我们的库存分析)。此外，研究人员可以使用nanoString来为现有的面板添加自定义探针集，或者设计完整的自定义面板。
*有关化验清单，请到nanoString主页并选择“产品”选项卡。
样品提交需求
所使用的分析方法和样品类型决定了所需的最小体积和浓度。请参阅nanoString nCounter分析样品需求指导为更多的信息。如果你没有要求的样品数量，请联系ATGC。
开始
*欢迎首次使用服务的用户要求免费会诊。要求会议请联系Denaha (D.J.)床铺或埃里卡·汤普森。
- 选择库存分析或从nanoString订购分析。请与D.J. Doss确认ATGC有哪些装备。
- 样品输入有特定要求，具体取决于样品类型。请参见样品需求指导，或与D.J.Doss联系，了解更多样品数量。
- 套件配置为12个样品，所以我们要求样品以12个的倍数提交。我们可以少试几次，但最低收费是12次。
- 将样品连同一份完整的服务请求表提交给位于BSRB 15层S15.8425房间的ATGC D.J.Doss。
- 样品将使用荧光测定法(Qubit)检测浓度，并使用NanoDrop检测质量。将执行额外的QC检查降解(碎片分析仪)。如果样品不合格，将通知客户。
- 项目按照它们被接收的顺序运行。如果没有其他项目在队列中，数据可能会在提交后4个工作日内可用。跑步不能在星期五开始。
- 数据以原始计数形式呈现。研究人员将负责使用nanoString的nSolver软件进行分析。这个软件是免费下载nanoString网站上的。请注意:您将需要创建一个帐户，以便下载软件。软件也包含在工具包的闪存驱动器上。
ATGC联系信息
D.J.床铺
djdoss@mdanderson.org
大卫·波洛克
dpollock@mdanderson.org
埃里卡·汤普森
ejthomps@mdanderson.org
NanoString支持联系信息
艾伦主教
德州大客户经理
电子邮件:ebishop@nanostring.com
克里斯托弗·德合
现场应用专家
电子邮件:cdeheer@nanostring.com
技术支持
电子邮件:support@nanostring.com